[蜕膜NK细胞KIR的基因分型与原因不明习惯性流产发病机制的研究]

　　[摘要] 目的 探讨免疫因素中蜕膜NK细胞KIR的基因分型对原因不明习惯性流产的发病机制。 方法 选择正常妊娠组28例孕产妇作为对照组，选择同期住院治疗的原因不明习惯性流产（三次以上不明原因的早期流产、并无活胎及中期流产史）为代表的病理妊娠组28例，分析两组的基因位点分布情况。 结果 发现14种KIR基因在URSA组与对照组蜕膜组织中均以不同频率表达，其中KIR2DL1、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3的基因频率均为100％；与对照组相比，RSA组蜕膜组织中KIR3DS1、KIR2DS5的基因频率显著升高，KIR2DL2的基因频率显著降低，其他KIR基因位点未发现有统计学差异。 结论 蜕膜NK细胞KIR的基因分型与原因不明习惯性流产密切相关。
　　[关键词] 蜕膜NK细胞；KIR的基因分型；原因不明习惯性流产
　　[中图分类号] R714.21[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）10-0038-03
　　The correlation of unexplained habitual abortion pathogenesis with NK cells and KIR genotyping
　　 ZHANG Jinmin1 YANG Chunbo2
　　1.Department of Obstetrics and Gynecology，Maternal and Child Healthcare Hospital of Xianju County in Zhejiang Province, Xianju 317300, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliated Obstetrics and Gyneclolgy Hospital of School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310006, China
　　[Abstract] ObjectiveTo study the immune factors in decidual NK cells in KIR genotyping of unexplained habitual abortion pathogenesis. Methods To selcet he normal pregnancy group 28 pregnant women as a control group, and to choose the same period of hospitalization unexplained recurrent miscarriages (three more unexplained early abortion; and medium-term abortion was not the history of live births), represented by the group of 28 pathological pregnancy. Comparative analysis of two loci distribution. Results tourteenkinds of KIR genes in URSA group and control group were different in the frequency of decidual expression, including KIR2DL1, KIR2DL4, KIR3DL2, KIR3DL3 gene frequency was 100%; compared with the control group, RSA group decidua in KIR3DS1, KIR2DS5 gene frequency was significantly increased, KIR2DL2 gene frequency was significantly reduced, the other KIR loci found no significant difference. Conclusion decidual NK cells and KIR genotyping unexplained habitual abortion is closely related.
　　[Key words] Decidual NK cells; KIR genotyping; Unexplained habitual abortion
　　原因不明习惯性流产（recurrent spontaneous abortion, RSA）的发病因素除了常规的解剖、遗传、内分泌及感染四大原因外，尚有很大比例与免疫因素密切相关[1]。母胎界面中滋养层细胞表达的HLA分子及蜕膜组织的免疫细胞在维持正常妊娠中起着重要作用。随着近年来NK受体理论的快速发展，研究者对NK细胞表面受体的作用已经初步达到共识；然而至今蜕膜局部KIR－HLAⅠ组合的分布格局仍不清楚，因此很大程度上影响了对蜕膜免疫细胞功能的评价以及对母胎免疫耐受机制的研究[2]。因此，研究正常和病理妊娠下，母体KIR受体分布格局及与配体HLA I类分子多态性的组合具有重要的临床意义[3]。本研究以母胎界面KIR－HLAⅠ组合多态性为切入点，在基因及蛋白水平分析KIR－HLAⅠ组合多态性，研究原因不明习惯性流产的发病机制。旨在阐明原因不明习惯性流产的发病机制，为临床上肿瘤、自身免疫病的免疫治疗以及预防器官移植排斥反应提供新的思路。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验设计
　　选择2007年1月~2008年1月我院住院进行产检的（至少有一顺产孩子）正常妊娠组28例孕产妇作为对照组，选择同期住院治疗的原因不明习惯性流产（3次以上不明原因的早期流产；并无活胎及中期流产史）为代表的病理妊娠组28例，年龄19～35岁。正常妊娠组（对照组）年龄18～34岁，两组年龄等一般资料比较，差异无显著性意义（P ＞ 0.05），具有可比性。
　　1.2 实验仪器
　　①DU800紫外分光光度计：美国Beckman公司；②MDF-U4086S超低温冰箱：美国SANYO公司；③Microfug-22R低温高速离心机：美国Beckman公司；④GIS-2010凝胶成像扫描系统（紫外）：Tanon公司；⑤GeneAmp PCR System 9600 PCR扩增仪：PERKIN ELMER公司；⑥H6-1微型电泳仪：美国BIO-RAD公司；⑦荧光定量 PCR仪：Rouch Lightcycler；⑧流式细胞仪：美国Beckman Coulter公司；⑨激光共聚焦显微镜（CLSM）：Nikon公司；⑩荧光倒置显微镜：OLYMPUS公司。
　　1.3 实验方法
　　1.3.1 蜕膜组织及绒毛组织单个核细胞的分离新鲜蜕膜组织及绒毛组织获自正常妊娠组和病理妊娠组妇女，洗去血液，剔除血管组织，剪碎，于玻璃研磨器内研磨，组织悬液过200目铜网，收集滤过的细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，用PBS洗2次。
　　1.3.2 盐析法抽提DNA在上述获得的单个核细胞悬液中加裂解液破坏细胞膜，裂解30 min后离心二次再加入表面活性剂蛋白酶K消化蛋白，然后再加入20% SDS和6 M NaCl充分沉淀，最后用氯仿-酚抽提，无水乙醇清洗沉淀DNA。
　　1.3.3 PCR-SSP方法检测蜕膜KIR参照文献[4]，合成特异性引物，经BLAST验序正确后，用PCR/SSP方法对蜕膜KIR进行基因位点低分辨率检测和单倍型分析。序列特异性引物聚合酶链反应(sequence specific primer polymerase chain reaction，PCR．SSP)检测蜕膜组织KIR基因，反应体系20 μL，含dNTP终浓度2 mmoL/L，MgCI2 2 mmol/L，引物终浓度214．3 nmol／L。反应条件：96℃ 1 min，96℃ 25 s，65℃ 45 s，72℃ 30 s，5个循环；96℃ 25 s，60℃ 45 s，72℃ 30秒，21个循环；96℃ 25秒，55℃ 1 min，72℃ 2 min，5个循环；72℃ 10 min。以KIR框架基因3DL2、3DL3、2DL4为内参照，不含DNA的PCR体系作阴性对照，所有样本重复测定2次。
　　1.4 统计学方法
　　KIR、HLA-C基因检出频率计算：检出个数／总数，应用SPSS15．0 统计学软件分析。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　蜕膜组织KIR基因频率用PCR-SSP法进行KIR基因分型，检测了迄今发现的14种KIR基因，结果发现14种KIR基因在URSA组与对照组蜕膜组织中均以不同频率表达，其中KIR2DL1、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3的基因频率均为100％；与对照组相比，病理妊娠组（RSA）蜕膜组织中KIR3DS1、KIR2DS5的基因频率显著升高（P ＜ 0.05），KIR2DL2的基因频率显著降低（P ＜ 0.05），其他KIR基因位点未发现有统计学差异（P ＞ 0.05）。
　　3 讨论
　　近年来“NK细胞受体”理论的迅速发展为我们研究NK细胞的功能提供了新的思路。大量研究证实，NK细胞表达能够特异性识别HLA I类分子的NK细胞受体，包括免疫球蛋白样受体（Ig-like receptors，KIR）、免疫球蛋白样转录物（Immunoglobulin like transcripts，ILT）和C-型凝集素样受体（C-type lectin receptors）三大类[5]。其中，KIR以其丰富的多态性尤为学者瞩目。KIR多态性表现在两个方面：其一，KIR的基因数目在不同NK细胞克隆、不同个体有差异，不同的个体可表现为不同的单元型。目前发现的单元型有两种组合，即以含有单一活化性KIR基因2DS4为特征的A型（A-haplotype）和以含有多种活化性KIR基因为特征的B型(B-haplotype)。其二，KIR的多态性还表现在同一KIR基因座位有多个不同等位基因，其中大多数为非同义突变。研究发现，各等位基因与不同配体的结合力不一样，从而影响其对NK细胞功能的调节[6]。
　　与KIR对应的HLAⅠ分子同样具有多态性。根据α1结构域77/80位含有不同氨基酸残基，HLA-C同种异型分子可以分为两组，第1组HLA-C的α重链第77位和第80位分别为丝氨酸和天冬酰胺残基，包括HLA-Cw1、-Cw3、-Cw7、-Cw8、-Cw13和HLA-Cw14；第2组HLA-C的α重链第77位和第80位分别为天冬氨酸和赖氨酸残基，包括HLA-Cw2、-Cw4、-Cw5、-Cw6、-Cw15、-Cw17、-Cw18。 HLA-G基因多态性包括编码区的多态性和非编码区的多态性。HLA-G基因编码区的多态性有限，主要表现为外显子2、3、4内单个核苷酸位点的突变和缺失，仅有15个等位基因，且多为同义突变，不改变HLA-G分子的二级结构，对HLA-G分子功能也无影响。HLA-G基因非编码区的多态性包括5’调控序列的多态性和3’非翻译区的多态性，与HLA-G分子的表达调控有关，部分决定HLA-G分子是否表达及表达的水平， 影响HLA-G分子的功能，并与病理性妊娠关系密切。单独或共表达在NK细胞上的KIR受体通过识别、结合相应的HLA I类分子配体，传递活化性或抑制性信号，协同调节效应细胞活性来维持母胎免疫耐受。另一方面，HLAⅠ分子对于蜕膜NK细胞表面受体的表达起着诱导调节的作用[7-8]。
　　以往对RSA发病机制的免疫机制遗传学方面的研究多局限于母胎界面HLA多态性的分析，而忽略了uNK细胞表面KIR受体的分析。而这也许就是问题的关键所在。试想占蜕膜局部绝大多数的uNK细胞表面表达众多KIR受体，通过识别、结合滋养层细胞表面相应的HLAⅠ分子，向胞内传递着活化及抑制信号，直接调节着uNK细胞的活性：包括关键细胞因子的分泌，细胞杀伤活性的调节。而这局部微环境的改变将最终影响着妊娠成败的结局。因此， KIR－HLAⅠ类分子分布格局的研究意义显而易见[9-11]。
　　为此，本课题拟在原有工作基础上，以母胎界面KIR－HLAⅠ组合多态性为切入点，首先从基因水平上进行KIR－HLAⅠ组合多态性研究，其次在蛋白水平上检测KIR－HLAⅠ的表达水平，观察uNK细胞的活性状态。
　　相信随着这些问题的解决，可以让我们更全面、更深层次地理解KIR－HLAⅠ组合多态性在母胎界面诱导维持母胎免疫耐受中所起的作用。这不仅为阐述RSA的发病机制提供新的理论基础，也可能为临床上免疫治疗RSA提供新的思路。
　　
　　[参考文献]
　　
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　　（收稿日期：2011-08-18）