TWEAK/Fn14在结节性红斑患者皮损组织中的表达
时间：2023-04-25 09:45:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
罗迈，彭雪婷，王思佳，刘玮，顾汉江，陆美，王亚琦，夏育民
结节性红斑(erythema nodosum, EN)是一种发生于皮下脂肪间隔的慢性炎症性疾病，好发于年轻女性，皮损多发生于下肢，主要表现为对称分布的鲜红色结节、斑块，自觉疼痛和压痛。结节性红斑可分为特发型和继发型两大类，大多数患者为特发型，病因不明；
继发型多与真菌感染、恶性肿瘤、妊娠、口服避孕药相关[1]。组织病理学表现为皮下脂肪间隔内炎症细胞浸润、脂肪肉芽肿、小叶间隔受累及毛细血管增生。结节性红斑发病机制复杂，目前尚未完全明确[2-3]。
肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)主要由炎症浸润组织中巨噬细胞等炎症细胞合成分泌，其唯一受体成纤维细胞生长诱导因子14(fibroblast growth factor-inducible 14, Fn14)结合TWEAK后可激活下游信号通路发挥调控作用。TWEAK/Fn14在生理条件下低表达，但在应激或者组织损伤时表达增加，轻度激活可促进组织再生和修复，过度及持续激活则会引起一系列炎症反应。TWEAK和受体Fn14结合后能诱导角质形成细胞、成纤维细胞、微血管内皮细胞等增殖、迁移和血管形成，并分泌IL-6、IL-8、调节正常T细胞表达和分泌的活性因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES)等促炎因子[4]。本课题组前期研究提出Fn14-TRAF2-TNFR信号轴观点：特定炎症微环境改变细胞的TNFR(肿瘤坏死因子受体)表达谱，免疫细胞分泌的TWEAK与细胞跨膜Fn14结合，通过肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor associated factor 2,TRAF2)将信号传导至TNFR亚型分子，继而调控细胞凋亡(TNFR1高表达)或增殖(TNFR2高表达)[5-6]。迄今为止，TWEAK/Fn14信号在结节性红斑中的表达尚无文献报道，因此本研究主要检测TWEAK/Fn14在结节性红斑患者组织中的表达水平，研究其在结节性红斑发病过程中的作用，并为其相关药物治疗提供方向。
1.1一般资料 选取2021年6月-2021年10月就诊于西安交通大学第二附属医院并于皮肤科完善皮肤活检的结节性红斑患者，其中男5例，女10例，年龄23～50岁。正常对照组来自皮肤科色素痣切除术的患者。入选标准：经临床及皮肤病理确诊的结节性红斑患者，即临床表现为下肢对称分布、伴有触痛的红色皮下结节或红斑，同时病理表现为小叶间隔受累为主的脂膜炎患者，且患者无其他皮肤病及全身系统性疾病。
1.2主要试剂与仪器 兔抗人Fn14多克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体(美国CST公司)，兔抗人TWEAK多克隆抗体(美国Abcam公司)，Trizol(invitrogen)；
逆转录试剂盒、SYBR Green(Takara)；
PCR引物(上海生工生物工程公司)；
实时荧光定量PCR仪(ABI)；
蛋白垂直电泳及转膜装置(德国BIO-RAD公司)。
1.3方法
1.3.1实时荧光定量PCR 取上述皮损组织和正常组织采用Trizol进行RNA提取，反转录后获得模板cDNA，实时荧光定量PCR检测组织中TWEAK、Fn14基因表达水平，TWEAK正向引物序列为5′-AGGTGTGGACGGGACAGTGAG-3′，反向引物序列为5′-CCAGCACACCATCCACCAG-3′，Fn14正向引物序列为5′-CTCTGAGCCTGACCTTCGTG-3′，反向引物序列为5′-GGGGGCACATTGTCACTGGA-3′，GAPDH正向引物序列为5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物序列为5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。引物合成于上海生工生物工程公司。
1.3.2蛋白印迹 RIPA裂解液提取组织总蛋白，BCA定量法测定蛋白浓度，加入5×loading buffer制定蛋白样品，95 ℃变性5 min，蛋白样品等质量等体积上样后进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入TWEAK、Fn14、β-actin抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后加入对应种属的二抗室温孵育1 h，PBST洗膜4次，ECL化学发光系统成像并进行灰度值统计。
1.3.3免疫组织化学染色 将切好的石蜡组织载玻片于62 ℃烘烤30～40 min，常规脱蜡、水化，抗原修复10 min后自然冷却至室温，PBS浸洗，组织表面滴加3%内源性过氧化物酶室温孵育10 min，PBS浸洗5 min，2%BSA封闭，37 ℃孵育30 min，滴加适当比例的一抗，4 ℃湿盒过夜。次日滴加DAKO二抗，DAB显色，苏木素复染，PBS返蓝，干燥后中性树胶封片。
2.1皮损组织及正常皮肤组织中TWEAK和Fn14分子mRNA表达差异比较 通过实时荧光定量PCR检测在结节性红斑患者和正常人皮肤组织中TWEAK/Fn14分子的表达水平，结果显示，皮损组织中TWEAK mRNA表达显著高于正常皮肤组织，差异有统计学意义(t=3.07，P<0.01)，Fn14在皮损组织中有上升趋势(t=0.34，P=0.74)，见图1。
Note: **P<0.01 vs. control group.图1 TWEAK/Fn14分子在皮肤组织中的mRNA表达水平Fig.1 The mRNA expression levels of both TWEAK and Fn14 in skin tissue
2.2皮损组织及正常皮肤组织中TWEAK和Fn14蛋白表达水平 蛋白印迹结果显示，结节性红斑患者皮损组织中TWEAK和Fn14蛋白表达水平升高，而正常皮肤组织中表达较低，统计结果用灰度值表示，差异均有统计学意义(TWEAK：t=3.68，P<0.01；
Fn14：t=7.67，P<0.000 1)，见图2。
Note: **P<0.01 vs. control group；
****P<0.000 1 vs. control group.图2a～2c TWEAK/Fn14蛋白在皮肤组织中的蛋白表达水平Fig.2a～2c The protein expression levels of both TWEAK and Fn14 in skin tissue
2.3免疫组织化学检测TWEAK和Fn14蛋白表达水平 免疫组织化学染色结果显示，TWEAK和Fn14蛋白主要在真皮层血管周围及脂肪小叶间隔表达，主要定位在细胞膜，为棕色颗粒沉积；
表皮层有少量表达。正常组织有少量阳性细胞着色，呈浅棕色，着色程度明显少于皮损组。TWEAK与Fn14均在结节性红斑患者中表达高于正常皮肤组织。采用Image J统计软件对阳性细胞面积进行统计学分析，差异有统计学意义(TWEAK：t=4.43，P<0.01；
Fn14：t=3.83，P<0.01)，见图3。
结节性红斑是皮肤中最常见的脂膜炎类型，其发病诱因较多，潜在因素复杂，发病机制仍不清楚，目前一般认为结节性红斑可能是机体的一种迟发型超敏反应，也可能是免疫复合物沉积在相应部位所致[1]。临床上主要依据临床表现、病史、实验室检查及组织病理进行综合诊断，有学者认为免疫功能紊乱是其发病的主要原因[7]。
早期结节性红斑患者伴有血管损伤、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润，炎症反应会扩散到真皮和小叶脂膜，晚期还伴有淋巴细胞和巨噬细胞浸润[8]。TWEAK是结构高度保守的Ⅱ型跨膜蛋白，分为可溶性TWEAK和膜结合性TWEAK，其唯一受体Fn14胞外区有一富含半胱氨酸的结构域可与TWEAK结合，胞质尾部含有TRAF结合位点。TWEAK主要通过分泌多种促炎因子、黏附分子和趋化因子，如RANTES、γ-干扰素诱导蛋白10(interferon gamma-induced protein 10, IP-10)和单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)，进而趋化巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞参与局部炎症反应[9-11]。在生理条件下TWEAK与Fn14的表达较低，组织损伤后其表达明显上调[12]。课题组前期研究证明，在狼疮性肾炎患者中，尿和血清中可溶性TWEAK水平升高与患者肾脏疾病活动相关。靶向TWEAK或其他抑制TWEAK/Fn14信号的中和抗体可减轻狼疮小鼠模型的肾脏损害程度[9]；
TWEAK/Fn14信号也参与银屑病的发展，Fn14缺失可改善银屑病样病变，并伴随病变皮肤炎症细胞浸润和促炎细胞因子产生减少[13-14]。此外，研究[15]表明，TWEAK/Fn14信号通路在过敏性紫癜的发病机制中也起着重要作用。TWEAK血清水平在急性期过敏性紫癜患者中升高，且与疾病的严重程度相关。然而，关于TWEAK/Fn14信号轴在结节性红斑中的表达尚无文献报道。本研究采用实时荧光定量PCR、蛋白印迹以及免疫组织化学的方法，检测皮损组织中TWEAK/Fn14 mRNA水平和蛋白水平变化。结果表明，与正常皮肤组织相比，结节性红斑患者皮损处TWEAK和受体Fn14显著高表达，主要在真皮层血管周围及脂肪小叶间隔。以往研究报道TWEAK/Fn14信号调控银屑病皮损中真皮微血管内皮细胞中炎症因子和趋化因子的表达，微血管内皮细胞通过表达黏附分子在白细胞募集中发挥重要作用。TWEAK/Fn14信号能刺激内皮细胞中趋化因子如CCL5及炎症相关黏附分子，如E-选择素、细胞间黏附分子Ⅰ和血管内皮生长因子-1的表达，促进血管增生，趋化白细胞、巨噬细胞等迁移至炎症部位，从而加剧炎症反应[4]。因此，推测TWEAK/Fn14信号通路的激活与真皮血管中趋化因子、炎症因子和黏附分子的募集分泌密切相关。
综上所述，本研究通过比较结节性红斑患者皮损组织及正常皮肤组织中TWEAK与Fn14的表达差异，提示TWEAK/Fn14通路可能在结节性红斑发病机制中起重要作用。后续本课题组会继续测定TWEAK/Fn14信号轴下游一系列趋化因子和炎症因子，扩大样本例数，进一步研究其调控机制，为结节性红斑的临床治疗提供新思路。
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