GHS-R1a对高脂饮食小鼠糖代谢及腹部脂肪影响
时间：2023-01-20 19:50:07 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
怀宙阳,董冰子,邓玉杰,尹艺蓉,信芳杰,李成乾
(1 青岛大学附属烟台毓璜顶医院保健科，山东 烟台 264000；
2 青岛大学附属医院内分泌科；
3 青岛大学附属医院病理科)
Ghrelin是一种包含28个氨基酸的脑肠肽，主要由胃底X/A样细胞分泌产生，是生长激素促分泌素受体(GHS-R)的内源性配体[1-2]。GHS-R包括GHS-R1a和GHS-R1b两种亚型。其中GHS-R1a活性较高，是Ghrelin最主要的内源性受体，也是发挥生物学效应最主要的亚型[3]。GHS-R1a主要表达于胰岛β细胞、垂体促生长激素细胞、下丘脑、海马、腹侧被盖区、黑质和中缝背核[4-7]。Ghrelin的主要功能是促进生长激素释放、食物摄取和脂肪沉积[8-10]。除此之外，Ghrelin还可以通过抑制胰岛素分泌和调节糖异生/糖原分解来调节葡萄糖稳态。Ghrelin信号通路已越来越被认为在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病中起到关键调节作用，而且多项研究表明其调节作用似乎独立于Ghrelin对食物摄入的影响[11-12]。目前关于Ghrelin及其受体在肥胖及糖代谢中的作用并未被完全阐明，有研究表明Ghrelin可增加胰岛β细胞数量并促进胰岛素的分泌[13-14]，亦有研究表明Ghrelin可抑制葡萄糖刺激下的胰岛素分泌[15-17]。Ghrelin及其受体在糖代谢中的作用尚存在争议。本研究旨在通过制备GHS-R1a基因敲除(KO)小鼠模型，探讨GHS-R1a对高脂饮食小鼠体质量、腹部脂肪及糖代谢的影响。
1.1 实验动物及分组
雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠购自维通利华实验动物技术有限公司(中国北京)。从上海南方模式生物研究中心获得C57BL/6背景下的GHS-R1aKO小鼠(GHSR-/-，GHS-R1a外显子1和2缺失)，在扩大群体前与C57BL/6小鼠回交7代以上[18-19]。小鼠饲养条件：环境温度25 ℃，12 h昼夜循环光照(7:00-19:00进行光照)，湿度50%～60%，自由运动、饮水及进食。选取6周龄WT雌性C57BL/6小鼠10只，随机分为普通饮食(脂肪质量分数为0.10)组(WT RD组，n=5)和高脂饮食(脂肪质量分数为0.60)组(WT HFD组，n=5)；
选取6周龄GHS-R1aKO雌性C57BL/6小鼠10只，随机分为普通饮食组(KO RD组，n=6)和高脂饮食组(KO HFD组，n=4)。小鼠的处理规程经青岛大学动物保护与使用委员会认证，本研究符合《实验室护理及使用指南》的指导方针。
1.2 观察指标及测定方法
从6周龄到15周龄，每周在同一时间(上午9:00-10:00)测量体质量。于16周龄时行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)：22:00至次日6:00禁食，收集各组小鼠的尾静脉血，应用美国强生公司生产的稳步血糖仪测定空腹血糖(即0 min血糖)，按照1.5 mg/kg剂量给予葡萄糖腹腔注射，测定注射后15、30、60、120 min血糖。17周龄时，将小鼠安乐死后取出肝脏及腹内白色脂肪组织，同时取血分离血清。取出的腹内脂肪称质量后在室温下置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定过夜，然后脱水并包埋在石蜡中，石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色。每只小鼠腹内脂肪石蜡切片在20倍光学显微镜下随机选取10个不同视野，应用Image J软件根据脂肪细胞轮廓范围计算每个脂肪细胞面积，最后取平均值得到单个脂肪细胞面积。计算腹内脂肪比例：腹内脂肪比例=腹内脂肪质量(g)/体质量(g)。并采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测各组小鼠血清胰岛素水平。
1.3 统计学方法
2.1 高脂饮食对KO小鼠体质量的影响
基因型、饮食方式、周龄对小鼠6～15周龄体质量的影响不存在交互作用(F=0.62～2.03，P>0.05)。单独效应分析显示，相同周龄时4组小鼠体质量比较差异均无显著性(P>0.05)。见图1。
图1 不同周龄时各组小鼠体质量比较
基因型和饮食方式对15周龄较6周龄小鼠体质量变化量的影响不存在交互作用(F=0.24，P>0.05)。单独效应分析显示，WT HFD组的体质量变化量明显高于WT RD组(F=6.99，P<0.05)，而KO HFD组与KO RD组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.2 高脂饮食对KO小鼠脂肪组织的影响
基因型和饮食方式对小鼠腹内脂肪质量、腹内脂肪比例的影响存在交互作用(F=5.85、6.55，P<0.05)，对肝脏质量的影响也不存在交互作用(F=2.54，P>0.05)。单独效应分析显示，WT HFD组小鼠腹内脂肪质量、腹内脂肪比例均显著大于KO HFD组(F=4.79、6.39，P<0.05)，而WT RD组与KO RD组比较差异均无显著性(P>0.05)。4组小鼠肝脏质量比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。
基因型和饮食方式对脂肪细胞面积的影响不存在交互作用(F=4.04，P>0.05)。单独效应分析显示，KO HFD组小鼠脂肪细胞面积较WT HFD组小(F=12.30，P<0.01)，而WT RD组和KO RD组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1和图2。
表1 各组小鼠体质量变化量及腹内脂肪指标的比较
A：WT RD组；
B：KO RD组；
C：WT HFD组；
D：KO HFD组。HE染色，20倍。
2.3 高脂饮食对KO小鼠糖代谢的影响
基因型和饮食方式对IPGTT血糖的影响不存在交互作用(F=1.09，P>0.05)。单独效应分析显示，WT HFD组小鼠的空腹血糖水平显著高于KO HFD组(P<0.01)，而WT RD组和KO RD组比较差异无显著性(P>0.05)；
WT HFD组小鼠注射后15 min血糖显著高于WT RD组和KO RD组(P<0.05)；
4组小鼠注射后30 min血糖水平比较差异无显著性(P>0.05)；
WT HFD组小鼠注射后60 min血糖水平显著高于KO RD组(P<0.05)；
4组小鼠注射后120 min血糖水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。
WT RD组与WT HFD组比较，*P<0.05；
KO RD组与WT HFD组比较，#P<0.05；
KO HFD组与WT HFD组比较，&P<0.05。
基因型和饮食方式对小鼠IPGTT曲线下面积(AUC)的影响不存在交互作用(F=2.18，P>0.05)。单独效应分析结果显示，WT HFD组明显高于KO HFD组(F=6.40，P<0.05)，而WT RD组与KO RD组差异无显著性(P>0.05)；
WT HFD组明显高于WT RD组(F=7.80，P<0.05)，而KO HFD组与KO RD组差异无显著意义(P>0.05)。见表2。
表2 各组小鼠IPGTT-AUC、空腹胰岛素水平比较
基因型和饮食方式对空腹胰岛素水平的影响存在交互作用(F=19.98，P<0.01)。单独效应分析显示，WT HFD组小鼠空腹胰岛素水平显著高于KO HFD组(F=26.88，P<0.01)，而WT RD组和KO RD组比较差异无显著性(P>0.05)；
WT HFD组空腹胰岛素水平显著高于WT RD组(F=25.30，P<0.01)，而KO HFD组和KO RD组比较差异无显著性(P>0.05)。见表2。
Ghrelin和其主要受体GHS-R1a通过作用于胰岛以及胰岛素作用的外周组织和大脑参与糖代谢[20]，但其机制尚未完全阐明。SUN等[21]在ob/ob小鼠模型中发现，敲除Ghrelin组小鼠血糖较对照组降低，葡萄糖诱导的胰岛素分泌增多，同时外周组织的胰岛素敏感性提高。但MA等[22]在ob/ob小鼠中发现，与对照组相比，GHS-R敲除组小鼠胰岛素水平更低，血糖更高，糖耐量异常的程度更重。与上述研究不同，本研究的雌性肥胖小鼠模型是由高脂饮食诱导的。本研究结果显示，在高脂饮食下，KO小鼠的空腹血糖和空腹胰岛素水平均显著低于WT小鼠，且IPGTT-AUC显著低于WT小鼠；
在普通饮食下，WT小鼠和KO小鼠的上述指标未见明显差异。提示GHS-R1a敲除可以抵抗高脂负荷引起的血糖升高，并增强胰岛素敏感性。而ZIGMAN等[23]的研究并未在高脂饮食和雌性小鼠中比较血糖和胰岛素水平，其结果仅显示，普通饮食下雄性GHS-R敲除小鼠血糖和空腹胰岛素水平较WT小鼠降低。
葡萄糖代谢产生的活性氧(ROS)可诱发胰岛素分泌，而线粒体解偶联蛋白2(UCP2)是β细胞ROS的负调控因子，Ghrelin的缺失降低了胰腺中UCP2 mRNA的表达，增强了葡萄糖诱导的胰岛素分泌[24-26]。已有研究结果表明，Ghrelin通过调节胰腺UCP2表达和胰岛素敏感性维持葡萄糖稳态[21]。MA等[22]在GHS-R敲除的ob/ob小鼠模型发现，GHS-R敲除损害了胰岛细胞功能，而GHS-R的缺失上调了胰腺中阴性的细胞调节因子(如UCP-2、SREBP-1c、ChREBP和MIF-1)，下调了阳性的细胞调节因子(如HIF-1、FGF-21和PDX-1)。本研究结果提示，GHS-R敲除对肥胖导致的血糖升高有保护作用，并可以增加胰岛素敏感性，其具体机制还有待进一步研究。
本研究结果显示，高脂饮食喂养WT小鼠的15周龄较6周龄体质量变化量显著高于普通饮食WT小鼠，而高脂饮食喂养KO小鼠体质量变化量与普通饮食KO小鼠比较差异无显著性，提示GHS-R敲除可能可以改善高脂饮食引起的肥胖。在本研究中，普通饮食下KO小鼠和WT小鼠的腹内脂肪质量、腹内脂肪比例均未见明显差异，而高脂饮食下WT小鼠腹内脂肪质量、腹内脂肪比例均显著大于KO小鼠，提示GHS-R1a敲除可以抵抗高脂饮食负荷引起的脂肪增加。脂肪组织表达丰富的GHS-R1a，有研究表明，GHS-R敲除减少了白色脂肪组织中的葡萄糖和脂质摄取，抑制了脂肪的生成，可改善肥胖[27-29]。但MA等[22]研究结果显示，GHS-R敲除ob/ob小鼠与GHS-R未被敲除ob/ob小鼠相比，体质量及体脂含量差异并无显著性，提示瘦素对体质量及脂肪的影响可能大于Ghrelin通过GHS-R介导的对体质量及脂肪的影响。今后课题组将进一步探索在高脂饮食诱导的肥胖小鼠和ob/ob小鼠中Ghrelin对糖脂代谢的作用。RASINENI等[30]研究发现，乙醇诱导的血清Ghrelin水平升高，可以促进脂肪释放游离脂肪酸，抑制脂联素并促进白细胞介素-6、趋化因子配体2等细胞因子的分泌，导致肝脏脂肪变性。本研究没有显示KO小鼠和WT小鼠在肝脏脂肪沉积程度上有差异。这可能与本研究小鼠数量较少有关，今后我们将增加小鼠数量，进一步探讨在GHS-R1a敲除小鼠模型中高脂饮食对肝脏脂肪沉积的影响。
综上所述，小鼠GHS-R1a敲除可以抵抗高脂饮食诱导的肥胖和腹部脂肪堆积，改善胰岛素敏感性和糖耐量异常，这为针对Ghrelin/GHS-R1a通路治疗肥胖和糖耐量异常提供了一定的理论依据。
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