【黄鳝T淋巴细胞数量的检测比较试验】t淋巴细胞功能

时间：2019-04-11 03:28:04　来源：柠檬阅读网本文已影响人

　　黄鳝具有很好的食用价值、药用价值和研究价值。黄鳝养殖业的发展，推动了其产品加工的发展，目前已有简单包装的生鲜冻鳝片和冻鳝丝的生产，也有真空软包装的休闲食品柳叶鳝丝、醋熏鳝片及酥香鳝骨的生产，还有鳝血酒及全鳝药用酒的生产。同时，由于鳝鱼体内富含DHA和药用成分，国内外已在深加工和保健品方面进行研究开发。黄鳝的全身除了头和内脏，基本上都可用于加工生产食品和药品。因此，黄鳝的市场开发价值较大，有很好的发展空间。
　　早期玫瑰花环形成的T淋巴细胞是对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，它与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一。在总玫瑰花环试验中，静止期和活动期的T淋巴细胞，均能与不同数量的SRBC自发形成E花环，所得E花环的百分率和绝对数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分率和总数。是目前鉴定和计算外周血液和各种淋巴样组织中T淋巴细胞的最常用方法之一。通过对黄鳝T淋巴细胞的测定，可以了解不同发育阶段黄鳝的免疫活性，运用到实践上，可以对不同阶段的黄鳝的免疫力的强弱进行针对性的照料，当其免疫力弱时，可以加强防病治病的力度，从而达到科技运用到实践中的目的。
　　材料与方法
　　·实验材料
　　1、实验动物
　　白兔:购于荆州沙市区钟鼓楼菜市场，体重1.32kg，试验前常温饲养10天。
　　不同规格的黄鳝15条，购于荆州花鸟鱼市场，试验前22℃饲养7天，数据如表1所示。
　　2、实验器材
　　离心机；移液枪；枪头；水浴锅；EP管；注射器；显微镜；计数板；载玻片；盖玻片；高温灭菌锅；冰箱；制冰机等。
　　3、实验试剂
　　瑞氏粉；甲醇；甘油；姬姆萨氏粉；戊二醛；碳酸氢钠；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；小牛血清；柠檬酸钠；柠檬酸；氯化钠；percoll分层液；蒸馏水；氯化钾；氢氧化钠等。
　　· 实验方法
　　1、黄鳝血液的制备
　　（1）取出黄鳝，用剪刀剪断其脊椎，使其瘫痪，失去抵抗。
　　（2）用剪刀对准肛门下方少许处斜向剪断尾部，将断口对准事先准备好的装有阿式液的EP管，血液自然流进EP管。
　　（3）当血液量少的时候可以适当轻挤黄鳝躯体，使血液能更多的被采集。
　　（4）将收集好的血液存放在碎冰上备用。
　　2、黄鳝淋巴细胞的分离
　　（1）将1份10�譖BS与9份Percoll贮存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是100 % Percoll悬液，其密度为1.1294 g/ml。
　　（2）用PBS稀释100% Percoll而获得所需密度的Percoll分离液。
　　（3）用稀释液稀释60 %则此时的Percoll分离液比重为1.0777g/ml，即可用于淋巴细胞的分离。
　　（4）取5ml的Percoll分离液于10ml的EP管中，将等倍稀释的黄鳝血液0.5ml小心叠加在分离液上。
　　（5）将EP管放在离心机上进行离心（1500rpm/min，10min）
　　（6）离心之后将EP管取出，可以看到EP管中有四个细胞层，从上到下第二层为淋巴细胞。
　　（7）用10um的移液枪小心的将这层细胞吸出，即为比较纯的淋巴细胞，将其收集好放在碎冰上备用。
　　3、兔红细胞的采集
　　（1）取5ml的注射器，用阿式液润洗。
　　（2）将白兔取出，按住其四肢和耳朵，让其面朝上躺着不能动弹。
　　（3）将注射器插入其心脏，缓缓抽出2ml血液，将血液迅速移入装有阿式液的EP管中，上下轻轻转动，让血液充分和阿式液混合。
　　（4）将制备好的兔血液放在碎冰上备用。
　　4、兔红细胞和黄鳝淋巴细胞的计数
　　（1）将采集好的兔红细胞稀释100倍，充分混匀。
　　（2）用移液枪吸取少量混液，小心的加在计数板上。
　　（3）将计数板放在显微镜下进行计数，计算出原兔红细胞的密度，配制出所需浓度的兔红细胞悬液
　　（4）用同样的方法配制出黄鳝淋巴细胞悬液。
　　5、玫瑰花环的形成
　　（1）取0.3ml小牛血清于1ml的EP管中，再加入0.3ml兔红细胞和0.1ml黄鳝淋巴细胞，混匀。
　　（2）将EP管放在37℃水浴锅中反应25min。
　　（3）将EP管取出，放在离心机里离心（500 rpm/min，5min）。
　　6、玫瑰花环的制片、染色及镜检；
　　（1）将1滴反应好的培养物滴在玻璃片上，用枪头将其均与的涂抹在一定范围之内。
　　（2）将玻璃片放在一边让其自然干燥，干燥后滴加1滴甲醛在上面，5min后用6.4的PBS液冲洗。
　　（3）等其自然干燥后再滴加瑞式液，4min后再用6.4的PBS液冲洗。
　　（4）等其自然干燥后再滴加吉姆萨式液，4min后用6.4PBS液冲洗，干燥。
　　（5）每份培养液制备3份玻璃片。
　　（6）将制备好的玻璃片放在显微镜下进行观察，凡吸附3个或更多家兔红细胞的单核细胞，为RE花环形成细胞，共计数100个细胞，计算出百分率
　　不同规格黄鳝T淋巴细胞数量的比较（如表2所示）
　　通过上面表格可以看到，随着黄鳝规格的变大，其E玫瑰花环形成率逐渐增高，这也就是说，随着黄鳝的长大，其免疫力会逐步增强，而小黄鳝的免疫力最弱，在生活当中，应该更加注重黄鳝幼体的防病抗病工作。
　　（作者单位：长江大学动物科学学院）

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