E.coli,DH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究|E.coli
时间：2019-04-14 03:19:55 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
[摘要] 目的：克隆并表达E.coli DH10B碱性磷酸酶（AKP）成熟肽基因（phoAm）， 为AKP的定向改构及应用奠定基础。方法：采用PCR法从E.coli DH10B基因组扩增phoAm；将phoAm克隆入表达载体pET28a，再转入E.coli BL21（DE3）进行表达；用免疫金层析法和SDS-PAGE法检测表达的重组rAKP；采用对硝基酚磷酸（pNPP）法测定rAKP的活性。结果：rAKP单体分子量约47 K，活性分析比对照菌提高21.5倍。结论：获得AKP成熟肽基因并得了到具有较高活性的重组rAKP。
[关键词] 碱性磷酸酶；大肠杆菌DH10B；表达纯化；活性分析
[中图分类号] Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）01（a）-028-03
Study on cloning, expression and activity of alkaline phosphatase from Escherichia coli DH10B
LI Jun1,2, HUANG Xia2, YAO Xuemei2, CHEN Xuefen2, QI Xingzhu2
1.Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Hainan Province, Haikou 570228, China; 2.Ocean College of Hainan University, Hainan Province, Haikou 570228, China
[Abstract] Objective: To clone and express alkaline phosphatase mature peptide gene of E.coli DH10B for the foundation of directed structural transformation and application of AKP. Methods: phoAm gene was amplified from E.coli DH10B genome by PCR; phoAm gene was cloned into pET28a and transformed into E.coli BL21(DE3); rAKP was detected by immuno-gold chromatography and SDS-PAGE; the activity of rAKP was determined by pNPP method. Results: Molecular weight of rAKP monomer was about 47 K, and activity of rAKP increased 21.5 times compared with the control. Conclusion: AKP matural peptide gene and rAKP with higher activity is acquired.
[Key words] Alkaline phosphatase; E.coli DH10B; Express and purify; Activity analysis
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是一类非特异性磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解[1]。AKP广泛存在于多种细菌、真菌和动物中。不同来源的AKP的相对分子质量和编码序列差异很大，且各种AKP的性质、结构、功能和催化机制也不完全相同。其中，E.coli AKP由phoA基因编码，为同源二聚体金属酶，单体由449个氨基酸组成，相对分子质量为47 K，活性中心包括3个金属原子，即2个锌原子和1个镁原子[2]。
E.coli AKP催化机制明确，底物范围广泛，作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。E.coli DH10B无致病性和耐药基因，是基因克隆的常用受体菌。本研究首次从E.coli DH10B基因组中克隆了AKP的成熟肽基因（phoAm）并进行了表达研究，从而为此种酶的结构、功能和应用研究打下了坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、载体 大肠杆菌菌株E.coli DH10B、E.coli BL21（DE3）、E.coli DH5α及原核表达载体pET28a（+）由热带生物资源教育部重点实验室保存。
1.1.2 试剂 T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、对硝基苯磷酸（pNPP）购自生工生物（上海）有限公司。质粒提取试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、Pfu DNA聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司。His标签蛋白纯化试剂盒、重组标签蛋白快速检测试剂盒GoldCassette-HIS购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.1.3 引物 引物设计后由生工生物（上海）有限公司合成。
1.1.4 仪器 UV-2450 紫外可见分光光度计（岛津）；超微量黑色石英比色皿（岛津）；PCR扩增仪（2720 Thermal Cycler Applied Biosystems）；凝胶成像系统（BioRad）。
1.2 方法
1.2.1 E.coli DH10B基因组DNA的提取与纯化 E.coli DH10B甘油菌经LB培养液增菌培养后，用天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取与纯化。提取的基因组DNA用紫外分光光度法进行评价。
1.2.2 引物设计 从Genbank数据库下载E.coli DH10B的phoA基因序列（accession number：NC-010473），使用Primer Premier 6.0和Oligo 7.37辅助设计用于扩增AKP phoAm的引物，为便于克隆进表达载体pET28a中，在引物两端加上适当的酶切位点和保护碱基。设计的引物如下，正向引物（phoAm-F）：5"-GTCATGGATCCCGGACACCAGAAATGCC-3"（BamHⅠ）；反向引物（phoAm-R）：5"-GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC-3"（HindⅢ）。
1.2.3 PCR法扩增phoA基因 在0.2 ml PCR管内配制50 μl反应体系，按下述程序进行PCR扩增：94℃预变性3 min；扩增30个循环，即94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 2 min；72℃延伸5 min。反应结束后，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测并进行测序。
1.2.4 phoAm基因的克隆 PCR产物经DNA产物纯化试剂盒纯化后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切，并与同样经BamHⅠ和HindⅢ双酶切的表达载体pET28a（+）经T4 DNA连接酶连接后，转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经LB/kan筛选平板培养后，用菌落PCR鉴定转化子。
1.2.5 phoAm基因的诱导表达 分别接种pET28a-phoAm/BL21（DE3）和pET28a/BL21（DE3）单菌落至5 ml LB培养液中，37℃振荡培养过夜。按1%的比例接种阳性菌液至100 ml LB培养液中，37℃振荡培养，至菌液OD600 nm约为0.4时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养3 h。
1.2.6 重组蛋白（rAKP）的检测 菌体离心后，加入缓冲液超声破碎，离心取上清液，用免疫金层析法检测6×His标签，用SDS-PAGE法检测表达蛋白。
1.2.7 重组蛋白（rAKP）的纯化 采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。对洗脱液进行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。
1.2.8 重组蛋白（rAKP）的活性分析 采用对硝基酚磷酸（pNPP）法测定rAKP的活性。取发酵菌体超声破碎后的上清液，加入测活液，30℃反应10 min，加入终止液终止反应，于波长410 nm处测吸收值。
2 结果
2.1 PCR扩增E.coli DH10B成熟肽基因（phoA）
PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上分析，可见1.4 kb的条带（图1）大小与预期一致。
1.DNA Marker；2.PCR产物
图1 E.coli DH10B phoAm PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
2.2 重组蛋白（rAKP）的表达与检测
重组菌诱导表达后，取超声破碎后的上清液，分别用免疫金层析法快速检测6×His标签（图2），用SDS-PAGE法检测表达蛋白（图3）。rAKP的分子量约为47 K。
1：阴性对照；2：rAKP（含6×His标签）
图2 免疫金层析法快速检测His标签蛋白
从左至右分别为诱导0、2、4 h；第4泳道为蛋白质分子量Marker
图3 SDS-PAGE检测诱导表达的rAKP
2.3 重组蛋白（rAKP）的活性分析
rAKP经活性分析，对照菌E.coli BL21（DE3）的OD405 nm为0.120，重组菌E.coli BL21（DE3）/phoAm的OD405 nm为2.58，即重组菌的碱性磷酸酶活性提高21.5倍。
3 讨论
本研究首次从E.coli DH10B菌株的基因组中克隆了碱性磷酸酶成熟肽基因，并进行了表达、纯化与活性研究。E.coli AKP作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。目前市场上常见的AKP产品有虾碱性磷酸酶（SAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP），其中CIAP的活性最高，约为天然E.coli AKP的40倍[3]。与天然提纯的SAP和CIAP相比，E.coli AKP的生产成本低，热稳定性好。由于AKP的构效关系明确，且在定点诱变和结构改造方面积累了一定的经验[4-5]。进一步研究可结合计算机模拟对E.coli AKP的三维结构与催化活性之间的关系进行深入分析[6]，利用当前蛋白质工程的先进技术手段对重组E.coli AKP进一步改构。
[参考文献]
[1] Coleman JE, Gettins P. Alkaline phosphatase, solution structure, and mechanism [J]. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1983,55:381-452.
[2] Coleman JE. Structure and mechanism of alkaline phosphatase [J]. Annu Rev Biophys Biomol Struct,1992,9(21):441-483.
[3] Wanner BL. Overlapping and separate control on the phosphateregulation in E.coli K12 [J]. J Mol Biol,1983,166:283-308.
[4] Muller BH, Lamoure C, Le D. Improving Escherichia coli alkaline phosphatase efficacy by additional mutations inside and outside the catalytic pocket [J]. Chembiochem,2001,(2):517-523.
[5] 王秋颖,李宁,向本琼.大肠杆菌碱性磷酸酶突变体的构建及其结构与功能研究[J].北京师范大学学报:自然科学版,2007,43(6):647-652.
[6] Lopez-Canut V, Roca M, Bertran J, et al. Promiscuity in alkaline phosphatase superfamily, unraveling evolution through molecular simulations [J]. J Am Chem Soc,2011,133(31):12050-12062.
（收稿日期：2011-08-08）
