附子联合MPTP诱导肝阳上亢型PD小鼠亚急性模型与慢性模型的建立及比较
时间：2023-06-19 21:00:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
荣 华 刘得水 张静艳 郭科东 渠丽丽 张晓杰 陆佰荣
帕金森病(Parkinson′s disease，PD)在中医学中属于“颤证”范畴，早在黄帝内经中就有“诸风掉眩，皆属于肝”记载[1]。PD的病机是肝肾阴虚，水不涵木，肝风内动，导致筋脉失其儒养而致病[2]。主要病理变化是中脑黑质和纹状体多巴胺(dopamine，DA)含量降低，TH是DA生物合成中的限速酶，在PD脑组织中，表达明显下降[3,4]。通常MPTP致PD小鼠模型作用明确，是目前常用的PD动物模型之一。急性和亚急性模型被应用的十分广泛，但是上述模型损伤在短期内恢复较快，而人类PD发病是一个长期的发展过程，因此需要一种能产生损伤并且保持时间长的动物模型才能与临床的病理变化更为接近[5,6]。中医临床诊疗PD的特点是“辨病与辨证结合”以往都是采用单纯的疾病动物模型而忽视了中医药自身特点，与中医临床实践衔接不够密切，因此本研究采用附子煎液灌服联合MPTP不同周期诱导，旨在建立病证结合动物模型，并通过行为学检测、病理学检测等手段验证慢性模型比急性模型更加稳定这一优势，证明慢性模型在研究PD的发病机制方面更具有可靠性。
1.实验材料：SPF级雄性C57BL/6小鼠60只，2～3月龄，体质量为20～25g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司[许可证号：SCXK(辽)2020-0001]。所有实验研究均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。附子煎液由单味附子组成[生药4g/(kg·d)，批号:000001294]购自北京同仁堂饮片有限责任公司。TH抗体购自美国Cell Signaling公司，批号(1)，SP法免疫组化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司(批号：00011404)。
2.动物分组、造模及给药：小鼠随机分为正常组、模型组、肝阳上亢PD亚急性组、肝阳上亢PD慢性组。肝阳上亢PD小鼠模型制备：附子煎液灌胃4周后，MPTP腹腔注射，肝阳上亢PD亚急性组给予25mg/(kg·d)共7 天，肝阳上亢PD慢性组给予25mg/(kg·d)，每3.5 天给药1次，为期5周[7～9]。
3.麻痹震颤评分标准：0分:与正常小鼠相似，无任何症状；
1分：竖毛、弓背、间断性细小震颤，但活动自如；
2分：吞咽频繁，频繁性震颤，后肢张开，颤尾，活动逐渐受限；
3分：流涎，持续性震颤，四肢僵硬，活动受限；
4分：因全身麻痹而死亡[10]。
4.易激惹程度的评定3级：Ⅰ级为捉持小鼠颈部时尖叫、惊跳；
Ⅱ级为捉持颈部时咬人；
Ⅲ级为提尾时尖叫、惊跳甚至咬人或同笼小鼠频繁打斗；
上述情况不明显为0级[11]。
5.爬杆实验：给药前3 天，每天进行1次爬杆训练。给药结束后第3 天，每天进行1次爬杆实验，持续到第7 天。制作直径为1cm，长50cm顶部固定直径为5cm的小球爬杆，用纱布缠绕防止动物攀爬发生打滑现象。测试时将小鼠放置球上，记录小鼠完全头向下爬到杆底部的时间。小鼠每天进行3次实验。评分标准：0分为爬杆时间<4.01s；
1分为4.01～8.00s；
2分为8.01 ～12.00s；
3分为>12.00s[12]。
6.转棒实验：给药前3 天，每天进行1次转棒训练。转速30r/min，训练时长3min，连续训练3 天。给药结束后，转棒实验以4r/min起始，加速度为0.12r/min，最大速度为40r/min，记录小鼠在5min内在转棒上停留时间，即转棒掉落潜伏期[13]。
7.免疫组化法检测TH阳性神经元平均光密度：4%多聚甲醛固定脑组织，4℃保存72h后，脱水浸蜡后进行石蜡包埋。中脑黑质区冠状切片，65℃烘片6h，进行脱蜡、水化处理后，开始TH免疫组织化学染色。
8.免疫印迹法检测TH蛋白表达：冰上快速取出中脑黑质区域[14]。BCA 法进行蛋白定量，SDS 凝胶电泳，转膜，封闭，加入 TH 抗体(1∶1000) 4℃ 过夜；
二抗(1∶6000) 孵育2h，ECL 化学发光反应，ImageJ 图像分析软件对免疫印迹条带进行密度扫描，以TH/GAPDH比较各组蛋白相对表达水平。
9.实时定量PCR法检测TH mRNA表达：取60mg脑组织，加入600μl Trizol溶液，脑组织在冰上进行匀浆处理提取总RNA，反转录合成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒进行扩增PCR。扩增实验结束之后，使用2-ΔΔCt法进行结果分析。
1.各组小鼠一般状态变化：与正常组比较，模型组、肝阳上亢PD亚急性组和肝阳上亢PD慢性组小鼠均在给予MPTP 5～30min内出现竖毛、弓背、肢体僵直、活动受限、身体震颤等现象。模型组及肝阳上亢PD亚急性组在给药后2～6h后逐渐恢复正常状态，肝阳上亢PD慢性组恢复时间明显长于其余3组。
2.各组小鼠麻痹震颤水平的变化：与正常组比较，模型组、肝阳上亢PD亚急性组和肝阳上亢PD慢性组小鼠均出现麻痹震颤的症状(P均<0.05)，与模型组比较，肝阳上亢PD亚急性组及肝阳上亢PD慢性组麻痹震颤评分升高(P<0.05)，且肝阳上亢PD慢性组麻痹震颤最为明显(P<0.05,表1)。
表1 各组小鼠麻痹震颤评分
3.各组小鼠易激惹程度的变化：与正常组比较，模型组、肝阳上亢PD亚急性组和肝阳上亢PD慢性组小鼠均出现性情变化，易激惹度提高(P<0.05)，与模型组比较，肝阳上亢PD亚急性组及肝阳上亢PD慢性组易激惹程度明显提高(P<0.05)，且肝阳上亢PD慢性组的易激惹程度最为明显(P<0.05,表2)。
表2 各组小鼠易激惹程度的变化(n=10)
4.爬杆实验：与正常组比较，模型组小鼠爬杆时间差异有统计学意义(P<0.05),肝阳上亢PD亚急性组小鼠爬杆时间较正常组有所延长(P<0.05)，肝阳上亢PD慢性组小鼠所用时间明显长于其他3组小鼠(P<0.05,表3)。
表3 各组小鼠爬杆时间与得分对比
5.转棒实验：与正常组比较，模型组小鼠、肝阳上亢PD亚急性组小鼠、肝阳上亢PD慢性组小鼠的在棒停留时间均有所缩短，差异均有统计学意义(P<0.05),而肝阳上亢PD慢性组小鼠在棒时间明显短于其他3组小鼠(P<0.05,表4)。
表4 各组小鼠转棒停留时间对比
6.各组小鼠免疫组化结果：与正常组比较，模型组、肝阳上亢PD亚急性组及肝阳上亢PD慢性组小鼠黑质TH平均光密度均有所降低(P<0.05)；
但肝阳上亢PD慢性组降低的最为显著(P<0.05,图1,表5)。
表5 各组小鼠黑质TH平均光密度比较
图1 各组小鼠TH表达水平(免疫组化法，×200)A.正常组;B.模型组;C.肝阳上亢PD亚急性组;D.肝阳上亢PD慢性组
7.各组小鼠黑质TH蛋白表达比较：与正常组比较，模型组小鼠与肝阳上亢PD亚急性组及肝阳上亢PD慢性组TH蛋白表达量均有所下调(P<0.05)，与模型组比较，肝阳上亢PD亚急性组及肝阳上亢PD慢性组的蛋白含量降低明显，肝阳上亢PD慢性组表达量下调最为明显(P<0.05,图2)。
图2 各组小鼠脑黑质区域TH蛋白表达差异A.TH免疫印迹图;B.TH统计直方图。与正常组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05;与肝阳上亢PD亚急性组比较，ΔP<0.05
8.各组小鼠黑质TH mRNA表达的比较：与正常组比较，模型组小鼠与肝阳上亢PD亚急性组及肝阳上亢PD慢性组TH mRNA表达量均有所下调(P<0.05)，与模型组比较，肝阳上亢PD亚急性组及肝阳上亢PD慢性组mRNA含量降低明显，其中肝阳上亢PD慢性组表达量下调最为显著(P<0.05,图3)。
图3 各组小鼠黑质区域TH mRNA的表达与正常组比较，*P<0.05；
与模型组比较，#P<0.05；
与肝阳上亢PD亚急性组比较，ΔP<0.05
PD是常见的神经退行性疾病，詹姆斯·帕金森于1817年首次对PD进行描述[15]。它是以DA神经元选择性丢失为主要特征的椎体外系疾病，多发生于老年群体。据统计，在60岁以上人群中发生率达到1%，即全世界有超过700万人患病，这导致一系列家庭、医疗和社会问题[16]。因此，成功建立PD动物模型是尤为重要的。既往采用MPTP诱导小鼠PD模型得到认可，但该种模型与中医药自身特点不符[17]。附子为大热之品，久用必耗伤精血，夺肝肾之阴而致肝肾阴虚，阴不潜阳而肝阳偏亢。肝阳上亢证是PD中的常见证型，临床中应用平肝潜阳药物治疗PD肝阳上亢证取得了较好的疗效，采用灼伤肝肾之阴而发生肝阳上亢灌服附子煎液联合 6-OHDA单侧损毁的方法，从病和证两方面综合模拟肝阳上亢证PD模型，与单纯PD模型和单纯肝阳上亢证候模型比较，在研究治疗PD药效评价方面更具特色和优势[18,19]。将辨病论与辨证论有机结合起来，病证结合的动物模型使很多“证”的不确定性因素由于“病”的限制变得清晰。
作为PD病理变化的主要特征黑质致密部多DA能神经元的丢失程度可导致疾病表现的差异。MPTP经腹腔注射后可迅速进入血-脑脊液屏障，生成MPP+与DA亲和，破坏黑质区DA能神经元，产生PD样病理变化，因此被常用于建立PD模型的诱导药物[20]。
附子煎液灌胃可以使小鼠出现烦躁，易激惹的表现，从而制备肝阳上亢证候模型[21]。PD具有周期长且呈进行性发展的趋势，因此需要能使损伤程度持久的模型这无疑是更接近于临床的病理特点，研究表明，MPTP诱导的小鼠模型应用较多的是急性或亚急性的模式，这种模型发生的损伤会在较短时间内得到恢复[22]。立足于此，本研究采用不同周期MPTP诱导联合附子进行周期灌胃，成功建立肝阳上亢PD亚急性模型及肝阳上亢PD慢性模型。
通过研究发现，模型组、肝阳上亢PD亚急性组及肝阳上亢PD慢性组小鼠在给药后均会出现竖毛、弓背、四肢僵硬、运动速度减慢，出现活动受限的现象。但肝阳上亢PD慢性组恢复时间与其他组比较，恢复时间较长，其余组在给药后2～6h内可逐渐恢复正常。对小鼠易激惹程度的观察，发现肝阳上亢PD小鼠易激惹程度更高，肝阳上亢PD慢性组小鼠表现的更为暴躁，出现捉颈时尖叫咬人，同笼打斗现象明显多于其他各组。通过爬杆、转棒实验检测小鼠行为学变化得知，与正常组比较，给药各组小鼠均出现了运动能力及平衡能力的损伤，而附子与MPTP联合用药肝阳上亢PD慢性组较单纯MPTP模型组及肝阳上亢PD亚急性组小鼠出现损伤程度更大，运动功能受损严重。行为学检测结束后，对各组小鼠中脑黑质DA能神经元标志物TH进行定位和定量的研究得知，给药各组小鼠均出现不同程度的TH表达量下降。与单纯西药模型组比较，肝阳上亢PD慢性组蛋白及mRNA表达含量降低的最为显著，由此认为肝阳上亢PD慢性组小鼠脑内多DA能神经元损伤程度较其余组要高。
综上所述，通过增加MPTP给药周期并联合附子构建小鼠肝阳上亢型PD慢性模型，从行为学、TH神经元标志物等方面分析比较可以初步验证，慢性模型是最稳定贴近于PD临床病理特征的建模方式，同时体现了中医学“辨病与辨证相结合”特点，将病证结合动物模型建立并研究运用，将会使中药防治PD基础研究更具有应用前景。
猜你喜欢爬杆阳上亢黑质针刺联合硝苯地平控释片对高血压头痛（肝阳上亢证）的治疗效果观察基层中医药(2022年7期)2022-11-17简论现代杂技中爬杆的技巧与艺术化演绎杂技与魔术(2022年3期)2022-11-06肝火旺和肝阳上亢，你会区分吗家庭科学·新健康(2022年6期)2022-06-15一种用于电力维修的爬杆机器人设计电力设备管理(2021年2期)2021-03-15帕金森病模型大鼠黑质磁共振ESWAN序列R2*值与酪氨酸羟化酶表达相关性的研究浙江医学(2020年9期)2020-07-01爬杆机器人设计电子制作(2018年17期)2018-09-28帕金森病患者黑质的磁共振成像研究进展卒中与神经疾病(2017年1期)2017-01-111H-MRS检测早期帕金森病纹状体、黑质的功能代谢磁共振成像(2015年7期)2015-12-23补肾活血颗粒对帕金森病模型大鼠黑质纹状体bcl-2、bax表达的影响环球中医药(2015年4期)2015-02-27简易爬杆设备在桥梁梁板架设中的运用山西建筑(2013年12期)2013-08-15
