基于稳定氧同位素的葡萄酒掺水鉴别方法研究
时间：2023-04-14 10:30:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
朱 莉，李叶凤，刘亚新，康天浩，谭 丹，刘敦华，张 昂
(1.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏银川 750021；
2.河北省葡萄酒质量安全检测重点实验室，河北秦皇岛 066000；
3.秦皇岛海关技术中心，河北秦皇岛 066000)
葡萄酒中富含多种氨基酸、矿物质和维生素，具有较高的营养价值和经济价值。随着全球化进程推进，葡萄酒行业发展迅速，市场的巨大潜力渐显[1-2]。在利益驱动下，葡萄酒掺假现象时有发生，不利于葡萄酒市场稳定发展。葡萄酒中掺水是制造假酒最常见的手段，其目的是降低酒精度或蓄意掺假。按照国家标准（GB/T 15037—2006）中对葡萄酒的定义，葡萄酒中的水应全部来自于葡萄原料，而非人为添加。因此，生产过程中不得外源掺水，但标准中缺少与之配套的葡萄酒中外源水的鉴别方法。目前，针对葡萄酒掺水行为，可用感官分析、可见-近红外光谱分析[3]、气相色谱分析[4]、高效液相色谱法分析[5]和稳定同位素比值质谱分析[6-12]等方法加以鉴别。但仅利用简单的理化指标或感官分析甄别葡萄酒掺水不够准确和严谨。光谱分析技术因其具有快速、无损、样品不需预处理等优点，常被用于葡萄酒掺伪鉴别[13-14]。有学者利用可见-近红外光谱技术检测了成品葡萄酒的掺水，对于发酵前掺水的鉴别研究尚未见报道。稳定同位素技术因其能提供无法复制或伪造的独特分子指纹，显示出了独特的优势[15]，利用稳定同位素技术可检测葡萄酒发酵前掺水。发展稳定同位素技术对葡萄酒掺假鉴别具有重要意义[16-18]。
本试验利用水平衡仪-稳定同位素质谱仪（EQ-IRMS）测定葡萄酒中水的δ18O，探讨掺入不同δ18O特征的外源水及其掺入量对葡萄酒中水的δ18O值的影响，初步建立基于稳定氧同位素的葡萄酒中外源水掺入的鉴别模型，旨在为我国葡萄酒掺水鉴别技术和相关标准的完善提供思路和借鉴，为推动稳定同位素技术在葡萄酒掺水鉴别领域的深入研究和实际应用提供参考。
1.1 材料、仪器
实验材料：采摘自香格里拉产区的葡萄样品和水。
仪器设备：旋转蒸发仪，德国Heidolph 公司；
气相色谱仪（GC 2023），日本岛津公司；
气相色谱-稳定同位素质谱联用仪，英国Sercon 公司；
水平衡制样系统，英国Sercon 公司；
恒温恒湿培养箱（APP260）。
1.2 试验方法
1.2.1 样品制备
通过减压旋转蒸发实现水中稳定氧同位素不同程度的分馏，制备了δ18O 值分别为-2.33 ‰（SD=0.10）、-4.35 ‰（SD=0.09）、-6.32 ‰（SD=0.03）、-8.36 ‰（SD=0.08）、-10.34 ‰（SD=0.01）、-12.33 ‰（SD=0.10）、-14.34 ‰（SD=0.05）、-16.33‰（SD=0.08）、-18.35‰（SD=0.06）的9 种外源水样品，基本覆盖全国不同地区自来水的δ18O范围（-17.74‰～-3.80‰）[19]。
针对蓄意的掺水行为，向理论酒精度8.0%vol、8.5 %vol、9.0 %vol、9.5 %vol、10.0 %vol 的葡萄汁中，掺入12.0%、17.0%、22.5%、26.0%、30.5%的9种δ18O值外源水，发酵预期酒精度为7.0%vol（国标规定葡萄酒最低酒度）的葡萄酒；
向理论酒精度14.0 %vol、15.0 %vol、16.0 %vol 的葡萄汁中，分别掺入7.0%、13.0%、18.5%的9 种δ18O 值外源水，发酵预期酒精度为13.0%vol（市售葡萄酒常见酒度）的葡萄酒；
针对降低酒精度的掺水行为，向理论酒精度17.0 %vol、18.0 %vol、19.0 %vol 的葡萄汁中，分别掺入5.5 %、11.5 %、15.5 %的9 种δ18O 值外源水，发酵预期酒精度为16.0%vol（普通酵母耐受的最高酒度）的葡萄酒。发酵在恒温恒湿培养箱（温度28 ℃、湿度60%RH）中完成。
1.2.2 氧同位素比值测定方法
利用EQ-IRMS 测定葡萄酒中水的δ18O，采用相对测量法表示样品中的稳定氧同位素值，结果以Delta(δ)符号表示。每个样品平行测定5次。
1.3 数据处理
使用Microsoft Office Excel 2019对测定数据进行分析处理，采用Origin 2020软件作图。
2.1 发酵对葡萄汁中水的δ18O影响
发酵前葡萄汁中水的δ18O（δ18Osample）和发酵后葡萄酒中水的δ18O（δ18Owine）见表1。
表1 葡萄汁发酵前后水中δ18O比较
结果表明，δ18Owine较δ18Osample偏负0.03 ‰，说明发酵过程中未发生明显的分馏效应。酒精发酵是非常复杂的生物化学反应，研究[20]发现丙酮酸分解生成乙醛和二氧化碳的过程中会发生氧同位素的分馏，乙醛还原为乙醇会导致水中δ18O 降低。事实上，只有很小一部分乙醛会还原为乙醇。因此，发酵对葡萄汁中水的δ18O影响很小。
2.2 基于稳定氧同位素构建葡萄酒掺水鉴别模型
掺入不同δ18O 特征、不同掺入量的外源水后，葡萄酒中水的δ18O 值见表2。由于葡萄汁掺水前后δ18O 差值很小，无法利用常规的显著性差异分析进行判断，本研究利用仪器测量精度（标准差SD=0.1）作为参考值判断葡萄酒是否掺水。葡萄酒中水的δ18O与掺水量的相关性分析见图1。
图1 葡萄酒中水的稳定氧同位素值与掺水量的相关性分析
表2 葡萄酒中水的δ18O
由图1 可知，加入较葡萄汁中水δ18O 偏正的外源水，掺水量与葡萄酒中水的δ18O 呈良好正相关关系；
当加入与葡萄汁中水δ18O 相比偏负的外源水后，随着掺水量的增加，葡萄酒中水的δ18O 逐渐偏负，掺水量与葡萄酒中水的δ18O 呈现明显且良好的线性负相关。加入δ18O为-2.33‰的外源水时，拟合方程为δ18O=0.0358x-5.8632（x 为外源水含量），R2=0.999，模型可判断至少7.0%的掺水量；
加入δ18O为-4.34‰的外源水时，拟合方程为δ18O=0.0156x-5.8566，R2=0.999，模型可判断至少13.0 %的掺水量；
加入δ18O 为-6.32 ‰的外源水时，拟合方程为δ18O=-0.0052x-5.8564，R2=0.985，掺水量达30.5%时，SD 仍小于0.100，预测模型不能判断30.5 %以下的掺水量；
掺入δ18O 为-6.32 ‰的外源水与葡萄汁中水的δ18O 值（-5.83 ‰）比较接近，即使掺水量很大，仍难以鉴别；
加入δ18O 为-8.36 ‰的外源水时，拟合方程为δ18O=-0.0240x-5.8734，R2=0.998，模型可判断至少11.5%的掺水量。
加入δ18O 为-10.34‰的外源水时，拟合方程为δ18O=-0.0446x-5.8620，R2=0.999；
加入δ18O 为-12.33 ‰的外源水时，拟合方程为δ18O=-0.0644x-5.8643，R2=0.999；
加入δ18O 为-14.34‰的外源水时，拟合方程为δ18O=-0.0841x-5.8681，R2=0.999；
加入δ18O 为-16.33 ‰的外源水时，拟合方程为δ18O=-0.1044x-5.8620，R2=0.999；
加入δ18O 为-18.35 ‰的外源水时，拟合方程为δ18O=-0.1232x-5.8664，R2=0.999。当掺入上述5 种不同δ18O 值的外源水，模型均可判断至少5.5%的掺水量。
为验证模型的有效性，选取掺水量为5.5%、11.5%、15.5%、22.5%、30.5%，掺入外源水δ18O为-6.32‰的葡萄酒样本，代入拟合方程δ18O=-0.0052x-5.8564，反演估算葡萄酒掺水量，真实值与估算值的关系如表3 所示。验证选取了拟合程度最低（R2=0.985）的拟合方程，得到样品真实值与估算值的平均相对误差仅为0.075，表明基于不同δ18O 特征外源水建立的掺水鉴别模型可靠性高，可以满足定量分析葡萄酒掺水的要求。
表3 葡萄酒样品估算结果
进一步分析，当δ18Osample与δ18Owater相差1.51 ‰时，模型能判断至少13.0 %的掺水量；
δ18Osample与δ18Owater相差2.50‰时，模型能判断至少11.5%的掺水量；
δ18Osample与δ18Owater相差3.53‰时，模型能判断至少7.0 %的掺水量；
δ18Osample与δ18Owater相差4.48 ‰时，模型能判断至少5.5%的掺水量。因此，依据葡萄汁中水的δ18O 与外源水δ18O 的绝对差值，利用模型可推断出掺水量的最低检出限值。结果见图2。
图2 掺水量的最低检出限结果分析
由图2 可知，δ18Osample与δ18Owater的绝对差值和掺入外源水量的最低检出限呈良好线性负相关变化，拟合方程为y=-2.7230x+17.4325（x 为δ18Osample与δ18Owater的绝对差值），R2=0.958，拟合效果良好。在实际应用时，该预测模型对任一地区葡萄酒的掺水鉴别均具有较高的参考价值。
本研究通过稳定同位素技术分析掺入不同δ18O特征外源水及其掺入量对葡萄酒中水的δ18O 值的影响，发现发酵前后葡萄汁中水的δ18O 变化很小，仅相差0.03‰；
掺入不同稳定氧同位素的外源水，掺水量与葡萄酒中水的δ18O 呈良好相关关系，并针对9 种不同δ18O 的外源水，建立了9 个鉴别模型，且利用模型反演估算的掺水量与实际掺水量的平均相对误差小于0.1；
根据葡萄汁中水的δ18O 与外源水δ18O 的绝对差值，可判断葡萄酒中外源水的最低掺入量，当葡萄汁中水的δ18O 与外源水δ18O 相差≥4.48‰，外源水占比≥5.5%时即可实现对葡萄酒的掺水鉴别。以上结果证明基于稳定氧同位素的葡萄酒掺水鉴别模型不仅可以快速鉴别葡萄酒是否掺水，还可准确定量外源水掺入量，可为违反葡萄酒国家标准的掺水行为提供鉴别方法和手段。针对葡萄酒掺假现象，在不断完善现有方法的同时，探索新型检测技术依旧是未来进一步研究的方向。随着行业和消费者产品真实性意识的增强、企业自律性的提高、掺假鉴别方法和葡萄酒标准体系的逐步完善，葡萄酒掺水问题将会逐步得到解决。
