基于高效液相色谱指纹图谱和化学模式识别的至宝三鞭丸质量一致性评价
时间：2023-03-11 11:40:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
王官连，张咏梅，高文雅，刘佳霖，鲍磊，刘传文，赵小亮，焦玥，刘洋，王志国，李涛，*，杜茂波*（.中国中医科学院中药研究所，北京 00700；
.烟台中亚至宝药业有限公司，山东 烟台 64000；
.中国中医科学院医学实验中心，北京 00700）
中药丸剂系指原料药物与适宜的辅料制成的球形或类球形固体制剂，主要包括蜜丸、水蜜丸、水丸等[1]。中药丸剂的使用历史悠久，众多使用至今的中医名方如六味地黄丸、逍遥丸等均为丸剂。据统计，2020年版《中国药典》一部收载的1607 种成方或单味制剂中，丸剂有412 种，占比达25%[2]。中药丸剂的配伍药味一般较多，且多以饮片细粉直接入药，辅料用量大，各药味占比较低，所以中药丸剂的物质基础研究更为复杂和困难[2]。高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析技术由于其覆盖性强、操作简单、使用经济等特点，在中药的物质基础研究方面显示出巨大的优势[3]。化学模式识别可以对指纹图谱进行数据降维、识别和分类，强调其相似性和差异性[4]。通过HPLC 指纹图谱等现代分析技术对中药的化学组成进行全面表征，进一步利用化学模式识别技术对其相似性或差异性进行分析，是建立中药丸剂质量评价和控制体系、提升制剂批次间一致性的有效途径。
至宝三鞭丸，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》（第十六册），是由海狗鞭、狗鞭、鹿鞭、人参、淫羊藿等40 多味中药配伍而成的中药蜜丸，具有补血生精、健脑补肾等功效[5]，用于治疗体质虚弱、腰背酸痛、肾亏遗精、神经衰弱等症[6-7]。据统计，至宝三鞭丸已在日本、东南亚、欧美等30 多个国家和地区销售，使用相当广泛，对其制剂质量的一致性进行评价至关重要。目前，对至宝三鞭丸的质量控制和物质基础有一定的研究，如使用薄层色谱对其当归的定性鉴别、HPLC 对其山茱萸中马钱苷的含量测定等[8-9]，但这些方法远不能全面表征其化学组成，制约了至宝三鞭丸制剂批间一致性的评价和进一步质量提升的要求。
前期，本课题组提出了应用“制剂质量标志物”进行中药制剂质量评价和控制的思路[10-12]，其主要包含以下特点：制剂质量标志物在中医药理论的指导下，依据临床适应证的要求，按照君-臣-佐-使配伍后产生；
制剂质量标志物不在原料阶段产生，而在制剂阶段产生，由工艺所决定；
制剂质量标志物可用于制剂的工艺筛选、质量评价及质量控制；
制剂质量标志物与临床适应证直接相关，其含量高低反映了药效的高低，也就是产品的优劣。本研究以已上市销售且广泛应用的中成药制剂至宝三鞭丸为研究对象，利用HPLC指纹图谱分析和化学模式识别等技术，对多个批次至宝三鞭丸制剂进行分析，探索中药丸剂物质基础全面表征、质量一致性评价策略，为筛选至宝三鞭丸制剂质量标志物提供前期研究基础。
1260 Infinity Ⅱ液相系统（美国Aglient 公司），包括G7111B 四元泵、G7129A 进样器、G7116A柱温箱、G7115A DAD 检测器和OpenLAB CDS 色谱数据系统等；
SCIENTZ-18N 型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
Milli-Q Integral 5 超纯水制备仪（美国Millipore 公司）；
甲醇、甲酸（北京Dikma 公司），其他试剂均为色谱级。
15 批次至宝三鞭丸样品由同一生产厂家按相同的制剂工艺制备，样品编号（批号）分别为S1（批号：200710）、S2（批号：200811）、S3（批号：200814）、S4（批号：200815）、S5（批号：201018）、S6（批号：201019）、S7（批号：201123）、S8（批号：201124）、S9（批号：201125）、S10（批号：201126）、S11（批号：201128）、S12（批号：201129）、S13（批号：201130）、S14（批号：210301）和S15（批号：210403）（烟台中亚医药保健酒有限公司）；
人参对照药材（批号：Y09S11H124052）、淫羊藿对照药材（批号：O21GB165114）（上海源叶生物科技有限公司）；
远志酮Ⅲ、丹皮酚、淫羊藿苷等对照品（成都普思生物科技股份有限公司），芍药苷、蛇床子素等对照品（成都曼思特生物科技有限公司）。
2.1 色谱条件
采用Waters BEH C18 色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；
流动相为0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～5 min，2%B；
5～15 min，2%～50%B；
15～45 min，50%～98%B；
45～50 min，98%B；
50～50.1 min，98%～2%B；
50.1～60 min，2%B）；
流速为0.2 mL·min－1；
柱温为35℃；
样品室温度为6℃；
检测波长为203 nm；
进样量为20 μL。
2.2 供试品溶液的制备
取至宝三鞭丸小蜜丸，剪碎。取剪碎后的小蜜丸样品约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液10 mL，称定重量，振摇至全部溶散，室温超声30 min 后，取出，放冷，再次称定重量，并用75%甲醇补足失重，摇匀，滤过，再取续滤液2 mL，用水定容至10 mL，摇匀，于20 000 g 离心15 min，上清液即为至宝三鞭丸供试品溶液。
2.3 人参、淫羊藿对照药材溶液的制备
取人参和淫羊藿对照药材粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液10 mL，称定重量，室温超声30 min 后，取出，放冷，再次称定重量，并用75%甲醇补足失重，摇匀，滤过，再取续滤液2 mL，用水稀释合适倍数，摇匀，于20 000 g 离心15 min，上清液即为人参（0.005 g·mL－1）和淫羊藿（0.002 g·mL－1）对照药材溶液。
2.4 对照品溶液的配制
精密称取各对照品约20 mg，分别置于5 mL量瓶中，加入甲醇溶解，配制成单个对照品储备液，稀释合适倍数备用。其中，淫羊藿苷使用50%甲醇溶解和配制。上述对照品溶液均低温密封保存。
2.5 精密度试验
精密吸取同一批次至宝三鞭丸供试品溶液，按“2.2”项下方法制备，连续进样6 次，以18 号淫羊藿苷色谱峰作为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间RSD＜0.12%，相对峰面积RSD＜1.5%，相似度在0.996 以上，表明该仪器精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批次至宝三鞭丸样品，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，进样测定，以18 号淫羊藿苷色谱峰作为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间RSD＜0.10%，相对峰面积RSD＜2.7%，相似度在0.994 以上，表明该方法重复性良好。
2.7 稳定性试验
取同一批次至宝三鞭丸样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在制备后0、4、8、12 和24 h 进行测定，以18 号淫羊藿苷色谱峰作为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间RSD＜0.11%，相对峰面积RSD＜3.1%，相似度在0.984 以上，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
2.8 指纹图谱研究
2.8.1 指纹图谱共有峰的标定 根据15 批次至宝三鞭丸样品检测的HPLC 图谱，选择稳定性、重复性较好及特征明显的色谱峰作为共有峰，共标定32 个（峰面积均大于总峰面积0.6%），典型的样品色谱图见图1。其中，18 号色谱峰的分离度好、峰高适中、峰面积稳定和保留时间居中（28.5 min），且已鉴定为淫羊藿苷，为至宝三鞭丸功效相关的活性成分[13]，因此选择18 号峰作为参照峰，计算至宝三鞭丸指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1。
表1 至宝三鞭丸指纹图谱各共有峰的相对保留时间与相对峰面积Tab 1 Relative retention time and relative peak area of the common peak in fingerprint of Zhibao Sanbian pill
2.8.2 指纹图谱色谱峰的归属和成分指认 取至宝三鞭丸供试品溶液，人参、淫羊藿对照药材溶液以及各对照品溶液，进样测定。结果归属了淫羊藿和人参对照药材在至宝三鞭丸中的特征峰，见图1，可知淫羊藿药材对至宝三鞭丸的6 号、7号、12 号、18 号、20 号、23 号、27 号、29 号、30 号和32 号峰有贡献，人参药材对27 号、28号、29 号和30 号峰有贡献。在至宝三鞭丸指纹图谱标定的共有峰中，淫羊藿药材至少贡献了10个峰，占总数的近33.3%。通过至宝三鞭丸样品与对照品的保留时间、紫外吸收光谱特征的比对，指认了至宝三鞭丸指纹图谱中5 个色谱峰，分别是芍药苷（7 号峰）、远志酮Ⅲ（11 号峰）、丹皮酚（16 号峰）、淫羊藿苷（18 号峰）和蛇床子素（21 号峰），见图1。
图1 至宝三鞭丸（A）、淫羊藿对照药材（B）和人参对照药材（C）的HPLC 图谱Fig 1 HPLC chromatogram of Zhibao Sanbian pill（A），Epimedii Folium（B）and Ginseng Radix Et Rhizoma（C）
2.8.3 指纹图谱的分析与相似度计算 取15 批次至宝三鞭丸供试品溶液，按建立的指纹图谱方法进行分析，将采集到15 批次指纹图谱数据以AIA 格式导入《中药指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》，以S12 为参照图谱，利用中位数法，设置时间窗为0.1 min，进行全谱峰匹配，对色谱峰进行多点校正后自动匹配，并进一步手动检查，生成至宝三鞭丸指纹图谱叠加图，见图2A。对15 批次至宝三鞭丸的指纹图谱与生成的对照图谱进行相似度计算，结果相似度为0.841～0.979，见表2，表明至宝三鞭丸各批次样品制剂的质量一致性尚可。
表2 15 批次至宝三鞭丸指纹图谱的相似度分析结果Tab 2 Similarity of fingerprint of Zhibao Sanbian pill
2.9 化学模式识别研究
至宝三鞭丸指纹图谱中32 个共有峰的峰面积相差较大（相对峰面积范围0.05～44.77），因此对各共有峰的峰面积进行均一化处理，即用每批次各峰的峰面积值除以15 批次峰面积均值结果表示，进行后续化学模式识别研究。
2.9.1 系统聚类分析（HCA） 以15 批次至宝三鞭丸指纹图谱中32 个共有峰均一化后的峰面积为变量，输入OriginPro 2019b 软件进行HCA 分析，采用平均聚合聚类方法，以平方欧氏距离为分类依据，绘制至宝三鞭丸聚类分析图，结果见图2B，可知当欧氏距离为4 时，15 批次至宝三鞭丸制剂聚为一类；
当欧氏距离为3 时，15 批次至宝三鞭丸制剂聚为两类：S14、S12、S11 聚为一类，其他聚为一类。
2.9.2 主成分分析（PCA） 以15 批次至宝三鞭丸指纹图谱中32 个共有峰均一化后的峰面积为变量，输入OriginPro 2019b 软件进行PCA 分析，得到PCA 得分图。结果见图2C，可知15 批至宝三鞭丸样品基本归为一类，其中S1、S12、S14和S15 相对中心距离较远，PCA 结果与HCA 结果具有一定相似性。另外，主成分因子载荷矩阵结果表明，14 号峰、28 号峰、15 号峰等对分类有重要贡献。
图2 至宝三鞭丸指纹图谱及对照指纹图谱（A）、系统聚类分析（B）和主成分分析（C）结果Fig 2 HPLC fingerprints（A），cluster analysis（B）and principal component analysis（C）of Zhibao Sanbian pill
中药丸剂的制备工艺大多以饮片原粉形式入药，在2020年版《中国药典》收录的中药丸剂中以原粉形式入药的制剂约占68.93%[1-2]，所以在色谱分析前需要对丸剂的提取方法进行考察。研究考察了热水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和纯甲醇作为提取溶剂，提取时间15、30、60 min 的提取效果，结果使用75%甲醇提取时样品的色谱峰数目更多、峰高更高，30 min 后各峰基本不再变化。但使用75%甲醇提取后，指纹图谱色谱图前段有一定的溶剂效应，出现色谱峰开裂等现象，所以续滤液进一步用纯水稀释5 倍后再进样分析。并且在进行人参、淫羊藿对照药材与至宝三鞭丸制剂比对时，其供试品溶液的制备方法和上述一致，以更客观分析两味药材对至宝三鞭丸指纹图谱的贡献。
至宝三鞭丸由40 多味中药配伍而成，其化学组成极其复杂，每一类成分的最大吸收波长都不同，所以在指纹图谱的分析中还考察了样品在203、230、256 和280 nm 波长下检测效果，结果在203 nm 检测波长下样品色谱峰信息最为丰富。这可能是至宝三鞭丸中萜类、苷类成分众多的缘故[14-15]，因此本研究选择人参、淫羊藿作为单味对照药材进行至宝三鞭丸指纹图谱中各色谱峰的比对，归属主要色谱峰。通过优化流动相的梯度洗脱方法，至宝三鞭丸和人参、淫羊藿等样品中主要色谱峰可在60 min 内分离完成。结果发现，淫羊藿贡献了共有峰总数的近33.3%。另外，通过至宝三鞭丸指纹图谱与人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、淫羊藿苷等30 多种对照品的分析比对，在至宝三鞭丸指纹图谱中指认了芍药苷、远志酮Ⅲ、丹皮酚、淫羊藿苷和蛇床子素等色谱峰，这些成分分别是白芍/芍药、远志、牡丹皮、淫羊藿和蛇床子等药材的特征性成分。研究表明，淫羊藿苷、芍药苷、远志酮Ⅲ、丹皮酚和蛇床子素等均具有一定的神经保护作用[13，16-19]，与至宝三鞭丸的药效相关，因此本研究建立的至宝三鞭丸的指纹图谱具有一定的代表性。
本研究结果表明15 批次至宝三鞭丸制剂的质量一致性尚可。但是，由于HPLC 指纹图谱的局限性，“三鞭”中海狗鞭、狗鞭、鹿鞭等的成分可能无紫外吸收，本研究的分析方法尚不能全部表征至宝三鞭丸的化学组成，并且也未对主要色谱峰进行鉴定和定量分析，如对聚类有重要影响的14 号、28 号和15 号峰，所以至宝三鞭丸的物质基础研究仍需进一步深入。
猜你喜欢 号峰指纹批号 一种JTIDS 信号批号的离线合批方法航天电子对抗(2022年4期)2022-10-24丹膝颗粒HPLC 指纹图谱的建立药品评价(2021年13期)2021-09-07像侦探一样提取指纹小哥白尼(趣味科学)(2021年11期)2021-02-28为什么每个人的指纹都不一样小天使·一年级语数英综合(2020年10期)2020-12-16清热祛湿颗粒HPLC 特征图谱中成药(2020年3期)2020-03-27基于指纹图谱的女金丸质量一致性评价药学研究(2019年5期)2019-06-05医学科技期刊中药品生产批号标注探析中国科技纵横(2018年2期)2018-11-29中药材批号划分与质量管理中成药(2018年7期)2018-08-04基于自适应稀疏变换的指纹图像压缩自动化学报(2016年8期)2016-04-16可疑的指纹青少年科技博览（中学版）(2015年7期)2015-08-12
