内皮素-1诱导A549细胞对Nur77表达的影响
时间：2023-02-17 15:05:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
严慧玲，黄玉兰，田喆，蒋玉洁
(1. 右江民族医学院研究生院，广西 百色 533000；
2. 右江民族医学院附属医院呼吸与危重症医学科，广西 百色 533000)
内皮素-1(Endothlin-1)是内皮素肽家族的主要亚型，大量存在于肺部上皮细胞、内皮细胞和炎症细胞中，通过介导支气管痉挛[1]、炎症细胞招募和激活[2]、肺血管收缩和重塑[3]等过程参与到哮喘、肺动脉高压等疾病的发病过程中。前期研究结果中发现在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的病理生理过程中升高的Endothlin-1可诱导产生全身性和肺动脉性高压，导致直接升高毛细血管静水压、直接增加内皮和上皮通透性、促进炎症细胞转移进入肺实质、抑制肺泡液体清除，进一步研究提示核受体亚家庭4，A组，成员1(Nur77)是Endothlin-1负向上游调控因子之一[4]。然而，Nur77对靶蛋白的调节机制复杂且多变，常与靶蛋白形成反馈调控环路。Endothlin-1对A549细胞Nur77的调控模式也值得被大家关注。
Nur77是核受体家族4A(NR4A)亚组中的一员，因为其内源性配体尚未被确定，因此也被称为孤儿核受体。此外，Nur77在核受体中也是独特的，它是一种可以由多种细胞外因素刺激诱导生存、分化和凋亡的立即早期基因[5]。Nur77的活动是通过其亚细胞定位进行调节的。在细胞核中，Nur77作为致癌生存因子发挥作用，促进癌细胞生长。相反，当它迁移到线粒体时与Bcl-2结合并转换其生存表型，引发细胞色素C的释放和凋亡[6]。因此，研究Nur77移位对了解其在细胞中发挥的作用至关重要。
1.1 细胞株 实验所需的A549细胞购自美国模式培养物集存库，由本实验室传代冻存。细胞培养条件为F-12K培养基+10% FBS，37 ℃，5%CO2，饱和湿度。
1.2 主要仪器和试剂 TriStar Lb941多功能酶标仪(BERTHOLD，德国)、DMIL LED倒置式生物显微镜(Lecica，德国)、激光扫描共聚焦显微镜(Olympus，日本)、LightCycler 96荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)、powerPac Basic蛋白电泳系统电源(Bio-Rad，美国)、TGEM Plus微量紫外分光光度计(天根，中国)、Tanon-5200 mμlti全自动化学发光图像分析系统(天能，中国)、Endothlin-1(货号：05-23-3800，Sigma)、CCK-8试剂盒(货号：CK04，Dojindo)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(货号：K1622，Thermo Fisher Scientific)、FastStart Universal SYBR Green Master(货号：03003230001，Roche)、FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(货号：S0007，Affinity)、Nur77抗体(C-5)(货号：sc-365113，Santa Cruz)、β-actin鼠单克隆抗体(货号：LF201，Epizyme)。
1.3 细胞生长曲线 观察A549细胞状态，将处于指数生长期的A549细胞用胰酶消化后制备成单细胞悬液，吹打均匀后种板。每隔12 h(分别为0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)加入CCK-8溶液，置于培养箱中孵育1 h，然后用酶标仪测定450 nm波长吸光度值，根据结果绘制生长曲线。
1.4 CCK-8实验 制备A549细胞悬液，分为5个实验组，每个实验中分别加入不同终浓度(0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM)的Endothlin-1，并设空白对照组，对照组及每个不同浓度的实验组均设5个复孔。按照设置的培养时间点取出培养板，加入CCK-8试剂，培养3 h后，酶标仪测450 nm波长处各孔的吸光度值并计算细胞相对增殖率(%)。
1.5 实时荧光定量PCR 使用Trizol法提取RNA，根据Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书要求将RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Green qPCR SupurMix，按照制造商的说明在PCR仪进行定量PCR检测，qRT-PCR结果归一化为GAPDH的表达，实验重复3次。
1.6 免疫印迹法 使用RIPA裂解液快速裂解细胞，裂解后收集蛋白并进行浓度测定。每个样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离后将蛋白电泳转移至PVDF膜上。封闭PVDF膜后加入一抗(Nur77，1∶1000；
β-actin，1∶5000)孵育过夜。第二天用HRP结合的二抗(1∶5000)室温下反应1 h，洗膜后加入ECL发光液反应数秒后采集图像，并计算灰度值。
1.7 免疫荧光 A549细胞接种于共聚焦平皿中，待单细胞平铺皿底后洗涤并固定。封闭后与一抗孵育过夜，然后洗涤后并与荧光二抗孵育1 h。洗涤后滴加抗荧光淬灭剂，随后在荧光显微镜下观察并拍照。
2.1 A549细胞生长曲线 通过检测A549细胞在0～3 d之内(共6个时间点)450nm波长处的吸光度值，用来间接反映A549细胞的生长状况。如图1所示，细胞OD值随着时间的增加经过潜伏期、指数增长期、平台期，趋于稳定后出现生长退化。
2.2 Endothlin-1对A549细胞的毒性作用 为探讨Endothlin-1对A549细胞生长的毒性作用，检测Endothlin-1处理A549细胞6 h、12 h、24 h、36 h、48 h后的细胞活力。不同浓度(0 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM)的Endothlin-1作用于A549细胞，干预6 h、12 h、24 h、36 h、48 h后，A549细胞的相对活力未出现明显抑制(P>0.05)，如图2所示。
注：检测时间点分别为0 h、12 h、24 h、36 h、 48 h、60 h、72 h；
OD：吸光度值。图1 A549细胞生长曲线图
2.3 外源性Endothlin-1刺激对Nur77 mRNA表达水平的影响 用qRT-PCR检测不同时间和浓度Endothlin-1刺激下Nur77 mRNA变化情况，如图3所示。在同一作用时间点内，不同Endothlin-1刺激浓度组与对照组比较Nur77 mRNA表达无明显变化(P>0.05)。
注：细胞相对增值率(%)=(实验组A450-空白组 A450)/(对照组A450-空白组A450)×100%。图2 不同浓度Endothlin-1对A549细胞 干预不同时间后的细胞活力
浓度梯度：0 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM；
时间梯度：0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h。图3 外源性Endothlin-1在不同浓度和时间刺激A549细胞的Nur77 mRNA表达水平
2.4 外源性Endothlin-1刺激对Nur77 蛋白表达水平的影响 用Western Blot检测不同时间和浓度在Endothlin-1刺激下的Nur77蛋白变化情况，如图4所示。在同一作用时间点内，不同Endothlin-1刺激浓度组与对照组比较Nur77的蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。由此可知，在Endothlin-1刺激下的Nur77表达并无呈现时间和浓度依赖性。
浓度梯度：0 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM；
时间梯度：0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h。图4 外源性Endothlin-1在不同浓度和时间刺激A549细胞的Nur77蛋白表达水平
2.5 Endothlin-1刺激诱导Nur77入核 检查Nur77在Endothlin-1刺激反应中的亚细胞定位，如图5所示。使用抗Nur77抗体进行免疫染色检查内源性Nur77亚细胞定位，并通过DAPI染色确定细胞核的位置。结果显示Nur77在Endothlin-1刺激后由细胞浆转移至细胞核。
注：绿色荧光标记Nur77，DAPI用于标记细胞核显示 蓝色荧光；
放大倍数：400倍，标尺：20 μm。图5 Endothlin-1刺激诱导Nur77入核
A549细胞虽然是肺癌细胞系，但具有Ⅱ型上皮细胞特性，经常被用作分析Ⅱ型上皮细胞的模型系统，在本项目中用于研究Endothlin-1对Nur77表达调控的机制。本课题组前期研究发现，Nur77作为转录因子调节下游靶基因的转录和表达，升高的Nur77可通过抑制NF-κB及p38 MAPK信号通路激活下调LPS诱导的A549细胞及LPS致ARDS大鼠Endothlin-1蛋白及mRNA表达水平，是Endothlin-1负向上游调控因子之一[4]。LI X X等[7]研究发现，NFATc1可在破骨细胞分化后期诱导Nur77表达，而Nur77又可反过来在转录水平上上调E3泛素连接酶Cbl-b，后者随后促进NFATc1蛋白降解，形成NFATc1→Nur77→Cblb→NFATc1负反馈调节机制。类似地，TO S K Y等[8]发现Nur77可与β-catenin形成正反馈调控环，进而促进结肠癌细胞的生长。这意味着Nur77对下游靶因子的调控机制复杂而多变，会与下游靶因子形成调控环路，并非简单的单向调控。Endothelin-1是一种含有21个氨基酸的肽类，属于内皮素家族的亚型之一，以旁分泌和自分泌方式普遍表达的应激反应调节剂，对平滑肌细胞具有血管收缩作用，有助于维持内源性血管舒缩功能，是血管扩张剂一氧化氮(NO)的天然对应物[9]，不仅被当作评估内皮功能的标志物[10]， 也被研究作为冠状动脉疾病、心肌梗塞和心力衰竭的预测因子和预后标志物[11]。物理因素，如剪切应力，或包括凝血酶、肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、生长因子、细胞因子和自由基在内的刺激会增强Endothlin-1的分泌，而NO、环状鸟苷一磷酸(cGMP)、心房利钠肽和前列环素等介质会减少内源性 Endothlin-1的释放，因此，在正常条件下，Endothlin-1 的作用是通过抑制或刺激Endothlin-1从内皮释放来进行调节的[12]。本课题组前期研究发现Endothlin-1 作为细胞因子之一，可调节机体内环境稳态、参与肺损伤炎症反应，在机体生理及病理过程中起着重要的作用。深入研究 Endothlin-1诱导A549细胞Nur77表达的影响，有助于加深对相关炎症性疾病病理生理过程的认识。然而，内源性产生的Endothelin-1被用于外源性刺激细胞的研究范例较为少见。因此，本研究采用CCK-8法对Endothlin-1体外培养A549后产生的细胞毒性进行测试。结果显示，不同浓度的Endothlin-1在不同时间点干预后，A549 细胞并未呈现出增殖抑制情况。本次研究尚未对Endothlin-1在动物模型中的作用做出阐述，今后的研究工作需要进一步深入探讨。
PAYAPILLY A等[13]研究认为，在某些类型的细胞中，由生长刺激诱导的Nur77在细胞核中作为转录因子，正向或负向调节参与细胞生存的基因的表达。Nur77也被某些凋亡刺激所诱导，并在适当的修饰下(可能是通过磷酸化和去磷酸化)，作为Nur77/RXR异源二聚体从细胞核迁移到细胞质，在那里它通过与Bcl-2结合靶向线粒体[6]。与Bcl-2的相互作用引起Bcl-2的构象变化，引发细胞色素C的释放和细胞凋亡。凋亡诱导剂(AHPN)和某些RXR配体可以通过诱导Nur77移位有效地诱导癌细胞凋亡[14]。这提示，Nur77移位对其生物学功能表达起着至关重要的作用，磷酸化可能在调控Nur77移位方面发挥了作用。在本次实验中，观察到Endothlin-1诱导A549细胞Nur77从细胞浆转移至细胞核，出现入核现象。神经生长因子诱导的Nur77出核需要丝裂原活化蛋白激酶途径使Nur77在Ser105(人类Nur77的Ser140)处磷酸化，这证明了磷酸化在Nur77出核中的作用[15]。Endothlin-1刺激是否影响Nur77的磷酸化以及磷酸化对调节其亚细胞定位仍在持续研究中。此外，到目前为止随着研究的深入，发现当检测Nur77蛋白表达水平时发现Endothlin-1外源性刺激条件下，Nur77蛋白条带带形上漂，推测这可能是翻译后修饰的结果。
综上所述，本次研究说明Endothlin-1外源性刺激对A549细胞无毒性作用，实验进一步验证了Endothlin-1诱导下对A549细胞Nur77 mRNA和蛋白表达无明显影响，通过一种与转录无关的机制介导Nur77从胞浆转移至胞核。本次实验为开展Endothlin-1对A549细胞Nur77表达调控研究提供前期准备，并为后续探讨Endothlin-1如何诱导Nur77亚细胞定位的研究奠定基础。
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