罗布麻微生物脱胶的菌种筛选与工艺优化
时间：2023-02-02 15:55:07 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
程 芬，张兴群,2，王云龙，王 颖
(1.新疆大学 纺织与服装学院，新疆 乌鲁木齐 830046；
2.东华大学 生物与医学工程学院，上海 201620)
罗布麻是新疆特色植物，被誉为野生纤维之王，对环境的适应能力强且具有较高的应用价值。罗布麻的叶不仅可制茶和饮料，还具有调节血压[1]、降低心脏病的发作[2]、抗糖尿病[3]、延缓衰老[4]等作用。此外，罗布麻的秆和麻皮可用于造纸，由麻秆韧皮部纤维制备的织物还具有高透气性、抗菌性、防紫外线等性能[5-6]。
为实现罗布麻纤用化，提高罗布麻利用率，研究人员做了大量的研究。其中，脱胶已成为罗布麻纤维加工过程中的关键工艺，目前麻纤维的脱胶主要有机械脱胶、化学脱胶、微生物脱胶等方法[7]。机械脱胶是利用麻木质部与韧皮部的物理力学性能差异使麻经碎茎机、打麻板的作用后其木质部碎、烂，胶质部分脱落，梳理、分离纤维的过程，纤维柔软但纤维损伤大，短纤率高，含杂多。化学脱胶是利用原麻中纤维素与胶杂质对酸、碱、氧化剂的稳定性不同，在不损伤或少损伤纤维原有机械性能的前提下使用化学药剂去除胶质的过程，脱胶高效，工艺参数易控制，但耗能大，设备投资大，成本高，且废水排放量大，污染环境。微生物脱胶就是利用“麻胶育菌、菌株产酶、酶解胶质”这一系列生化循环反应，温和高效且绿色环保地脱去麻纤维中的胶质[8-9]；
但在脱胶过程中菌株的产酶力和脱胶工艺参数会直接影响脱胶效果甚至纤维的品质[10]，因此筛选脱胶效果好，能耗低且对麻纤维损伤小的菌株是微生物脱胶研究中长期且基础的工作[11-12]。
新疆地区日照时间长，昼夜温差大，土地干旱且高盐碱。野生麻类在此条件下生长，其土壤中的微生物经过长期的物竞天择，对环境的适应性较强，且有些菌株可能会因以麻秆中的胶质作为营养来源具有一定的脱胶能力。在筛选新疆地区野生麻生境土壤中具有脱胶能力的菌株的过程中，可能会发现新的脱胶菌株或脱胶菌株新的复配方式，从而提高罗布麻微生物脱胶效率，因此，本文试验采集乌鲁木齐南山野生麻生长地土样，分离、筛选、鉴定了土壤及腐烂麻中具有脱胶效果的细菌，并使用正交试验优化脱胶工艺，以残胶率、断裂强度对其脱胶效果进行了表征，以期提高罗布麻的脱胶效率，同时也为麻类微生物脱胶提供更多的选择。
1.1 试验材料
土样：6份，采自新疆乌鲁木齐南山野生麻生长区。
基础材料：3, 5-二硝基水杨酸(DNS)试剂、0.15%刚果红(CR)溶液(自配)，其余试剂为分析纯。
培养基：罗布麻培养基(罗布麻茎粉10 g，硫酸铵5 g，磷酸二氢钾1 g，氯化钾5 g，氯化钙0.2 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，去离子水1 L，pH值7.2)；
分离培养基(果胶4 g，其他无机成分同罗布麻培养基)；
果胶固体培养基(果胶4 g，硫酸铵3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.1 g，琼脂粉18 g，去离子水1 L，pH值7.2)；
木聚糖固体培养基(木聚糖 4 g，其他无机成分同果胶培养基)；
发酵培养基(牛肉膏3 g，果胶0.5 g，木聚糖0.5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钾1 g，去离子水1 L，pH值7.2)。
1.2 试验方法
1.2.1 微生物富集
分别称取土样和罗布麻茎粉各5 g加入盛有45 mL无菌水且有玻璃珠的三角瓶中，振荡打散后37 ℃静置培养48 h，在罗布麻培养基接入45 mL培养液上清连续静置培养传代，以第3代上清作为富集培养液。
1.2.2 菌株初筛
取富集培养液梯度稀释10-4、10-5、10-6倍，取各梯度稀释菌液0.2 mL分别涂布于分离培养基，30 ℃培养24 h至长出菌落。分离不同形态的菌株，并挑选单菌落分别接种于罗布麻培养基，于37 ℃静置培养48 h，得到初筛菌液。
1.2.3 透明圈法复筛
将初筛菌液分别涂布于果胶、木聚糖培养基中，37 ℃培养72 h后,加入0.15% CR染液染色处理30 min(覆盖质量浓度为1 mg/mL)，倒去CR溶液后加入1 mol/L氯化钠溶液脱色处理30 min，挑选菌落周围出现明显透明圈[13]的培养基，用游标卡尺以十字交叉法测量水解圈直径和菌落直径，并计算水解圈直径与菌落直径的比值(HC)，筛选HC值大的菌株进一步进行酶活测定。
1.2.4 酶活测定
标准曲线制作：配制1 mg/mL木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖溶液，稀释不同浓度(见表1)后与DNS试剂进行显色反应，测定540 nm处的吸光度并绘制标准曲线，用于果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶活性的计算。
表1 糖标液配制
粗酶液制备：将复筛菌株以2%的比例接种于发酵培养基中，在37 ℃、180 r/min条件培养14 h，发酵液经4 ℃、4 000 r/min离心15 min后的上清液即粗酶液。
酶活力测定：采用DNS比色法[14]分别测定木聚糖酶、果胶酶以及纤维素酶的酶活。在25 mL比色管中分别加入1 mL底物(果胶、木聚糖、羧甲基纤维素钠溶液)、0.2 mL粗酶液，50 ℃水浴反应30 min后加入2.0 mL DNS试剂显色处理，再检测540 nm处的吸光度值，根据标准曲线计算还原糖量，从而计算酶活。最终根据酶活大小筛出木聚糖酶活、果胶酶活高而低(或无)纤维素酶活的菌株。酶活计算公式如下：
式中：E为酶活力，U/mL；
S为还原糖量，mg/mL；
T为反应时间30 min；
M为酶量，本文为0.2 mL。
1.2.5 菌株鉴定
将酶活测定后筛得的新鲜菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进行16 S rRNA测序。采用通用引物27 F(5′-A G A G T T T G A T C M T G G C T C A G-3′)和1492 R(5′-T A C G G Y T A C C T T G T T A C G A C T T-3′)进行扩增，参比GenBank中序列相似性较高的菌株、序列与得到的基因序列进行对比分析。
1.2.6 单菌株脱胶工艺优化
对所筛最优势脱胶菌株X7进行单菌株脱胶工艺优化。按照正交试验因素水平表(见表2)设计正交试验，分别参照GB 5889—1986《苎麻化学成分定量分析方法》和GB/T 5886—1986《苎麻单纤维断裂强度试验方法》测试残胶率和断裂强度，以残胶率和断裂强度作为参考指标分析结果，并以优化后的工艺条件进行脱胶，检测其残胶率。
表2 正交试验因素水平表
2.1 菌株分离初筛
自然条件下，野生罗布麻生长环境中微生物可利用的营养物质匮乏，通过长期自然条件的筛选，罗布麻腐烂的叶、茎成为某些微生物生长的主要营养来源，这些菌株可能具有一定的脱胶能力，因此首先采用平板稀释法从6 份土样中共分离出112 株菌，分别将其接种于以罗布麻茎粉为唯一碳源的培养基中，对可能具有脱胶效果的菌株进行初筛，最终初筛得到对罗布麻可能具备一定脱胶能力的菌75 株。
2.2 刚果红水解圈复筛
罗布麻微生物脱胶主要以去除果胶、半纤维素(包括木聚糖、阿拉伯木聚糖等)等胶质为主[15]。果胶、半纤维素都属于多糖类物质，可被菌株产生的果胶酶、木聚糖酶分解为单糖、二糖等小分子物质，从而使纤维从胶质的包裹中分离出来。果胶、木聚糖琼脂培养基中因含有果胶、木聚糖这类大分子多聚糖可以和刚果红染料结合，从而使平板显红色。但在平板中接种具有脱胶效果的菌株后，菌株产生的果胶酶、木聚糖酶会分解培养基中的果胶、木聚糖，培养基无法与刚果红染料结合而生成红色复合物[16]，菌体周围形成以菌体为中心的透明水解圈。菌体产生的果胶酶、木聚糖酶以菌体为中心向外扩散，浓度逐渐降低，培养基中没有被分解的果胶、木聚糖就会与刚果红染料结合而显色。通过是否产生透明圈、透明圈与菌落直径的比值及刚果红染色的深浅对初筛获得的75 株菌进行复筛发现，有51 株菌能够在木聚糖培养基产生水解圈，28 株菌能够在果胶培养基产生水解圈，25 株菌在果胶、木聚糖培养基均能产生水解圈，因此初步判断这25 株菌可能具有生产果胶酶和木聚糖酶的能力。对这25 株菌进行编号以备后续试验，如图1所示。
图1 菌株刚果红HC值
2.3 酶活分析
麻微生物脱胶要求在不损伤或低损伤纤维的前提下尽可能地除去胶质，因而要求脱胶菌分泌的酶具备高果胶酶活、高木聚糖酶活，低或无纤维素酶活。而果胶、木聚糖、纤维素等大分子经微生物分泌的酶催化降解后生成的还原糖(半乳糖醛酸、葡萄糖或低聚木糖等)能使DNS还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，且酶促反应过程中酶活大小与生成的还原糖量呈正比[17-18]，因此通过测量溶液中还原糖的浓度评价各株菌的果胶酶活、纤维素酶活和木聚糖酶活。经酶活测定后筛选出优势脱胶菌9株(如表3所示)，所有菌株分泌纤维素酶的能力较低，果胶及木聚糖酶活性较高，理论上具有一定脱胶能力，且除菌株Y8外其余菌株的纤维素酶活均在0.22 U/mL及以下，对纤维损伤较小。
表3 酶活测定结果
2.4 16 S rRNA测序
经测序比对序列后剔除重复菌株，得到优势脱胶菌7株分别如表4所示，其中Y8、YE13、Z4、2-1菌株的16 S rRNA基因序列与芽孢杆菌属的基因序列同源性分别为100.00%、100.00%、100.00%、99.86%，可被认定为芽孢杆菌属；
L1菌株的16 S rRNA基因序列与大肠杆菌属的同源性为99.36%，可被认定为大肠杆菌属；
X7菌株的16 S rRNA基因序列与克雷伯菌属的同源性为100.00%，可被认定为克雷伯菌属；
GAN1的16 S rRNA基因序列与泛菌属的同源性为98.73%，可被认定为泛菌属。
表4 菌株基因序列比对结果
芽孢杆菌属是目前分离出的能够降解麻胶质的主用菌种之一，可分泌果胶酶、半纤维素酶以及少量的纤维素酶，这与麻脱胶要求菌株高产果胶酶、木聚糖酶，低(或不)产纤维素酶以达到高效降解果胶、半纤维素而不损伤纤维的目的相适应。泛菌属是肠杆菌科中不被包裹、不形成孢子的革兰氏阴性细菌，一般定殖于植物根部，具有植物促生特性，经过麻生长环境的长期选择而具备一定的脱胶能力，也在一些麻脱胶的研究中被应用[19]。细菌鉴定后并未发现新型菌株，但是也筛到了芽孢杆菌属这类主用脱胶菌种以及泛菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属这几种较少使用的脱胶菌种，这将有助于突破麻微生物脱胶菌株集中使用黑曲霉、芽孢杆菌、肠杆菌、欧文氏菌等的局限，增加脱胶菌的多样性。
2.5 正交优化结果分析
以摇床转速(A因素)、脱胶溶液pH值(B因素)、浴比(C因素)对所筛最优势脱胶菌株X7进行单菌株脱胶工艺参数的优化，结果见表5。
表5 微生物脱胶正交试验优化结果
由表5可知，A、B、C这3个因素对残胶率影响的重要程度为：C>A>B，即浴比>摇床转速>脱胶液初始pH值，最佳水平组合为：A2B3C2，对纤维断裂强度影响的重要程度为：A>B>C，即摇床转速>脱胶液初始pH值>浴比，最佳水平组合为：A2B1C1。
利用方差分析、显著性检验确定三因素对残胶率和纤维断裂强度影响的显著性，从最佳水平组合中确定出最佳工艺参数，结果如表6所示。3个因素对残胶率影响为：C、A对残胶率影响极显著，B对残胶率影响显著，即摇床转速和浴比对残胶率影响极显著，脱胶液初始pH值对残胶率影响显著，三因素对断裂强度的影响为：B、A对纤维断裂强度影响显著，而C对纤维断裂强度的影响不显著，即摇床转速和脱胶液初始pH值对纤维断裂强度影响显著，浴比影响不显著。综合摇床转速、脱胶溶液pH值、浴比对残胶率和断裂强度影响的显著性，考虑在不影响纤维断裂强度的条件下获得尽可能低的残胶率，本次试验最优的脱胶工艺参数为A2B1C2，即当摇床转速为90 r/min，溶液pH值为7，浴比为1∶40时具有最佳脱胶效果。
表6 方差分析表
2.6 脱胶效果分析
在最佳工艺参数条件下，对X7单菌株以及X7菌株与本次试验分离的其他6株菌复配的脱胶效果进行测试，通过检测残胶率评价脱胶效果，结果见表7。
表7 脱胶效果验证表
由表7可知，在最佳工艺参数条件下，复配菌株的脱胶效果都要优于单菌株脱胶，其中7株菌株复配的脱胶效果最好，残胶率为30.45%，说明构建复合菌系脱胶效果更好，最佳脱胶方式为7菌系复合脱胶。这可能是由于所筛的7株优势脱胶菌的复合系中菌株之间形成了稳定的脱胶菌群，且脱胶过程中各菌株发挥作用不同，存在种间协同作用且还可能存在菌株之间的拮抗作用，协同效果大于拮抗效果，从而改变菌群的脱胶能力[20]。此外，C6/1的脱胶能力(残胶率50.74%)比其组成菌株中的菌株X7、L1、2-1的单一菌株脱胶时的能力弱(即菌株X7、L1、2-1在复合菌群中未发挥出最佳脱胶效能)，说明复合菌系脱胶时同时存在菌种之间的协同作用、拮抗作用影响菌系脱胶效果。
本文以新疆乌鲁木齐南山野生麻生长区土壤为样筛菌，并用所筛菌株优化罗布麻脱胶工艺，以提高罗布麻的微生物脱胶效率，主要得出以下结论：
1)最终筛得7株菌，主要为芽孢杆菌属，此外还有肠杆菌属、克雷伯菌属和泛菌属。
2)所筛菌株分泌纤维素酶的能力较低，果胶及木聚糖酶活性较高纤维素酶活低，具备一定脱胶力且对纤维损伤小，这些特点均适用于实际麻微生物脱胶应用。
3)在脱胶液pH值为7，浴比为1∶40，摇床转速为90 r/min的条件下，菌株单独或复配都能够有效对麻纤维进行脱胶，且上述7菌系复合脱胶有更好脱胶效果，这将有助于突破麻微生物脱胶菌株集中使用芽孢杆菌、黑曲霉、肠杆菌、欧文氏菌等菌种的局限，丰富麻脱胶菌种多样性，为麻微生物脱胶提供了更多的选择。
4)在下阶段的研究中将扩大菌种筛选范围，对新疆其他野生麻生长区内土壤微生物进行筛选，以期从中发现更适于实际罗布麻微生物脱胶的新型优势脱胶菌株。
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