基于线粒体DNA,tRNAleu-COⅡ序列的浙江省东方蜜蜂遗传多样性研究
时间：2023-01-26 13:35:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
曹联飞，施金虎，徐雅岚，苏晓玲，胡福良，郑火青，*
(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021；
2.浙江省畜牧技术推广与种畜禽监测总站，浙江 杭州 310021；
3.浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058；
4.金华市农业科学研究院，浙江 金华 321000)
东方蜜蜂(Apiscerana)是蜜蜂属的一个种，在我国一般称为中华蜜蜂，简称中蜂，俗称土蜂，广泛分布于我国大部分地区，尤其是在南方的丘陵、山区[1]。东方蜜蜂在我国饲养历史悠久，适应能力强，善于采集零星蜜源，是重要的产蜜昆虫和授粉昆虫。由于引进种西方蜜蜂的竞争与生态环境改变，东方蜜蜂在我国的分布范围大幅缩小，数量骤减[2]，2006年被列入《国家畜禽遗传资源保护名录》。近些年，由于畜牧业产业转型和生态环境改善等因素，我国的东方蜜蜂数量又迅速增加。
遗传多样性研究是蜜蜂资源保护和利用的基础，尤其对于经历了群体快速缩减和快速扩增的东方蜜蜂具有重要意义。我国分布的东方蜜蜂一般划分为9大类型：北方中蜂、华南中蜂、华中中蜂、云贵高原中蜂、长白山中蜂、海南中蜂、阿坝中蜂、滇南中蜂和西藏中蜂[1]。近些年，线粒体、微卫星、SNP等分子标记在我国东方蜜蜂的遗传多样性研究中得到了大量应用，取得了新的进展。姜玉锁等[3]基于线粒体DNA tRNAleu-COⅡ序列研究发现，我国不同地理型东方蜜蜂存在较明显的遗传分化。Gong等[4]基于线粒体DNA COⅠ序列研究发现，我国南方地区东方蜜蜂的遗传多样性高于北方地区，东方蜜蜂群体间存在明显的遗传结构。张爽等[5]基于微卫星分子标记研究发现，我国5个东方蜜蜂自然群体遗传多样性丰富，群体间遗传分化明显。Li等[6]基于SNP分子标记研究发现，我国不同生态区的东方蜜蜂存在较大的遗传差异。Ji等[7]基于SNP分子标记研究发现，我国现有的东方蜜蜂种群由7个独立的遗传单元组成，它们的遗传差异程度已经达到了西方蜜蜂的亚种水平，为我国东方蜜蜂的分类提供了新的见解。
浙江省东方蜜蜂饲养历史悠久，复杂多山的地理条件和季风性湿润气候条件非常有利于东方蜜蜂的生存繁衍。浙江省东方蜜蜂群体数量增长迅速，已由2015年的10多万群增长到2018年的40余万群[8]，近两年维持在60万群左右。关于浙江省东方蜜蜂的遗传多样性研究，赵东绪等[9]基于形态学研究发现，浙江省东方蜜蜂变异丰富；
曹联飞等[10]利用微卫星分子标记初步研究发现，浙江省东方蜜蜂遗传多样性相对较低。曹联飞等[11-12]基于线粒体DNA tRNAleu-COⅡ序列对浙江丽水、金华的东方蜜蜂进行了详细研究。然而，已有研究存在样本数量不足或样本不全面等问题，尤其关于浙江省东方蜜蜂的类型划分还没有确切的结论。鉴于此，在之前研究的基础上，本研究全面收集浙江省的东方蜜蜂样本，基于常用的线粒体tRNAleu-COⅡ序列进行遗传变异和群体遗传结构等分析，从而深入了解浙江省东方蜜蜂的遗传多样性状况，为浙江省东方蜜蜂的有效保护和合理利用提供科学依据。
1.1 样本收集
在已获得浙江丽水、金华2个地级市东方蜜蜂样本和研究数据的基础上[11-12]，2015—2019年在浙江省其他8个地级市的25个县级行政区采集东方蜜蜂273群，最终获得覆盖浙江省10个地级市43个县级行政区的448个东方蜜蜂样本(表1)。
表1 浙江省东方蜜蜂样本信息
县级行政区的选择综合考虑东方蜜蜂分布数量、地理位置等因素。每个县级行政区一般随机选择3个蜂场，每个蜂场一般采集3～5群东方蜜蜂，部分地区根据东方蜜蜂群体分布数量适当增减样本数。采集样本的蜂场为长期定地饲养，蜂群来源以本地野生收捕为主。每群随机取30只左右的工蜂个体，用无水乙醇浸泡冷冻保存。
1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA提取
对本研究新采集的273群东方蜜蜂样本进行基因组DNA提取，方法同文献[12]。无水乙醇浸泡保存的工蜂样本，每群随机取1只剪取胸部肌肉，按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取蜜蜂总DNA。
1.2.2 序列扩增与测序
序列扩增与测序方法同文献[12]。使用引物E2和H2扩增线粒体DNA tRNAleu-COⅡ序列。对PCR产物进行双向测序。
1.2.3 数据分析
以NCBI提交的浙江省丽水市的东方蜜蜂单倍型序列[11]为参照，利用DNAStar 5.0软件(DNASTAR Inc.， Madison，WI)对测序数据进行校对和序列拼接。将本研究测序获得的273个东方蜜蜂样本数据，与已有的浙江丽水、金华的东方蜜蜂研究数据[11-12]进行联合分析。用Clustal X 2.0软件[13]进行序列比对和结果输出。使用MEGA 7.0软件[14]输出变异位点、简约信息位点，计算遗传距离，构建系统发育树等。用DnaSP 6.0软件[15]划分单倍型，进行单倍型多样度、核苷酸多样度和核苷酸差异数等计算。利用Network 4.0软件[16]进行单倍型网络图构建。使用Arlequin 3.5软件[17]计算群体间遗传分化指数(F-statistics，FST)，并进行显著性检验，利用分子方差分析检测遗传变异来源，并进行Tajima’sD和Fu’sFs中性检验[18-19]。
2.1 序列变异与单倍型划分
获得448条浙江省东方蜜蜂序列，大部分序列长度为414 bp，有17条序列缺失1个碱基，为413 bp；
有1条序列插入2个碱基，为416 bp，有2条序列插入4个碱基，为418 bp。碱基缺失和插入均发生在非编码区。序列变异分析显示，共有48个变异位点，其中缺失和插入位点为5个，其余43个变异位点中包括14个简约信息位点和29个单一多态位点。
根据变异位点，448群浙江省东方蜜蜂可划分为46个单倍型。NCBI数据库比对结果显示，4个单倍型尚未见报道，新申请的NCBI登录号为OM386847—OM386850，另外1个单倍型为我国国内首次报道，申请的NCBI登录号为OM386851。
2.2 群体多样性与中性检验
按照浙江省10个地级市划分地理群体，各地理群体和总体的样本数、单倍型数、多样性指数见表2。各地理群体和总体均表现出较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性。
表2 浙江省东方蜜蜂遗传多样性指数
浙江省东方蜜蜂总体的单倍型多样度为0.665 7，核苷酸多样度为0.002 61，核苷酸平均差异数为1.076。各个地理群体中，特有单倍型数以丽水、金华、杭州较多，分别为9、5、4个；
单倍型多样度以舟山、湖州、丽水较高，分别为1.000 0、0.866 7、0.772 0；
核苷酸多样度以温州、舟山、丽水较高，分别为0.003 85、0.003 62、0.003 52；
核苷酸平均差异数以温州、舟山、丽水较大，分别为1.595、1.500、1.452。
中性检验结果显示，所有地理群体和总体的Tajima’sD值和Fu’sFs值均为负值，除衢州群体和湖州群体的Tajima’sD和Fu’sFs中性检验不显著、温州群体的Fu’sFs中性检验不显著、舟山群体的Tajima’sD中性检验不显著外，其他地理群体和总体的中性检验均显著。
2.3 网络图与群体遗传结构
为直观分析单倍型的地理分布，以及单倍型之间的演化关系，构建单倍型网络图，结果如图1所示。单倍型H1在10个地理群体中均有分布，覆盖的样本数占浙江省东方蜜蜂总样本数的56.7%，为浙江省东方蜜蜂的主体单倍型。以单倍型H1为中心，其他单倍型辐射分布。单倍型H5和H3分布也较广，单倍型H5在除金华和湖州的其他8个地级市均有分布，单倍型H3在除温州、衢州、舟山的其他7个地级市均有分布。外围的单倍型则分布较局限，如样本数量较多的单倍型H18只分布于丽水和衢州。最外围的单倍型则主要分布于某一个地区，如单倍型H24只分布于杭州。在温州2个样本中发现的单倍型H40(NCBI登录号OM386851)与主体单倍型和其他单倍型的分支距离较远。
图1 浙江省东方蜜蜂单倍型网络图Fig.1 Network of haplotypes of Apis cerana in Zhejiang Province
10个地理群体间的遗传距离和遗传分化指数见表3。浙江省东方蜜蜂群体间的遗传距离较小，在0.001 73～0.003 82。各群体间遗传分化指数FST也较小，变化范围为-0.040 97～0.100 38，大部分FST<0.05。两两群体间，遗传分化程度相对较高且差异显著的有：杭州与金华(FST=0.076 98)，杭州与衢州(FST=0.072 10)，杭州与宁波(FST=0.099 91)，宁波与金华(FST=0.071 92)，宁波与台州(FST=0.081 59)，宁波与绍兴(FST=0.083 23)。说明杭州和宁波与周边地区可能存在遗传分化。
表3 浙江省东方蜜蜂群体间的遗传距离(对角线上)与遗传分化指数(对角线下)
分子变异分析结果如表4所示。按照10个地理群体划分，群体内变异占87.59%，组内群体间变异占11.16%，10个地理群体组间变异占1.25%。说明主要遗传变异来自群体内。进一步按照浙江省自然地理区划分，主要遗传变异也来自群体内，占总变异的87.53%，组内群体间变异占11.45%，本研究样本所在的5个自然地理区组间变异只占1.02%。
表4 浙江省东方蜜蜂分子变异的空间方差分析
2.4 单倍型系统发育分析
从NCBI下载已报道的东方蜜蜂其他主要单倍型序列，与本研究获得的浙江省东方蜜蜂单倍型序列进行合并分析。所有单倍型序列截齐一致后为307 bp。由于分析序列缩短，本研究获得的46个单倍型序列进一步合并为20个单倍型序列。以沙巴蜂为外群，构建的系统发育树如图2所示。浙江省东方蜜蜂的大部分单倍型聚在一起，与台湾、印度的3个黑色东方蜜蜂样本，以及俄罗斯远东、韩国、日本、越南等地的样本关系较近，进一步与文莱和马来西亚的2个单倍型序列聚在一起。值得注意的是，本研究获得的单倍型H40与印度的一个黑色东方蜜蜂样本聚在一起，与其他单倍型关系较远，与单倍型网络图显示的结果一致。而作为区别于其他地区东方蜜蜂的潜在新种，印度的3个黄色东方蜜蜂样本聚在一起，与其他东方蜜蜂单倍型关系很远。
单倍型H1在浙江省10个地理群体中均有分布，占总样本数的56.7%，为浙江省东方蜜蜂的主体单倍型。结合已有文献报道，这一单倍型也是邻近福建省东方蜜蜂的主体单倍型(59.9%)[21]，以及广西(58.62%)[22]、秦巴山区(54%)[23]等地的主体单倍型。单倍型网络图分析显示，其他单倍型以单倍型H1为中心辐射分布，说明单倍型H1可能是较原始的、适应能力较强的并在群体中稳定存在的优势单倍型。Gong等[4]研究发现，来自中国大部分地区东方蜜蜂的单倍型网络图呈星状辐射分布。星状辐射分布通常提示群体在历史进化过程中经历了群体扩张事件[24]。本研究中性检验结果显示，所有地理群体和总体的Tajima’sD值和Fu’sFs值均为负值且大部分检验显著，也支持浙江省东方蜜蜂可能经历了群体扩张的推测。邻近的福建省东方蜜蜂相关研究也显示其有群体扩张现象[21]。
按照Grant等[25]提出的标准，通常单倍型多样度(Hd)≥0.5且核苷酸多样度(Pi)<0.005时，是由于种群经历瓶颈效应后迅速扩张所致。相对于单倍型多样度，浙江省东方蜜蜂的核苷酸多样度偏低，也可以解释为经历了快速扩张。种群扩张过程中会积累大量碱基突变，因此单倍型会非常丰富，但是难以积累充足的核苷酸变异[26]。Gong等[4]对中国大部分地区东方蜜蜂的研究也显示出高单倍型多样度和低核苷酸多样度的特点。已有研究表明，历史气候变化对东方蜜蜂种群数量具有显著影响，当气候适宜时植物茂盛，食物充足，种群数量迅速增加，当气候恶劣时食物减少，种群数量迅速减少，形成“离心机”模型[7]。
基于448个东方蜜蜂样本结果显示，浙江省东方蜜蜂总体的单倍型多样度为0.665 7，核苷酸多样度为0.002 61，核苷酸平均差异数为1.076。基于相似样本数量的邻近福建省东方蜜蜂研究显示，单倍型多样度为0.484 3，核苷酸多样度为0.001 93，核苷酸平均差异数为0.687[21]。浙江省东方蜜蜂遗传多样性总体高于福建省东方蜜蜂，这可能与浙江省地理类型更丰富有关，也可能与福建省东方蜜蜂采样地点较少有关。浙江省10个地理群体中，丽水和温州的样本遗传多样性相对较高，舟山由于样本太少可信度较差。丽水和温州位于浙江南部，为多山地区，蜜粉源植物种类丰富，自然环境非常适合东方蜜蜂生存，可能有助于形成较高的遗传多样性。
遗传结构分析显示，浙江省东方蜜蜂10个地理群体间的遗传距离和遗传分化指数都较小，分子变异分析显示主要遗传变异来自群体内。邻近福建省的东方蜜蜂研究结果也显示遗传分化指数较小[21]。但是，浙江省东方蜜蜂大部分地理群体也有自己独特的单倍型，可能与各个地区东方蜜蜂的独立进化和长期生存适应有关。目前《中国畜禽遗传资源志-蜜蜂志》将浙江省分布的东方蜜蜂划归为两大类型，基本上以钱塘江水系干流为分界线，西北侧主要是杭州、湖州和衢州北部划为华中中蜂，东南侧浙江省其他地市划为华南中蜂[1]。本研究的遗传分化分析显示，杭州与宁波、金华、衢州等地区的FST值为0.05～0.15，表明群体间存在中等程度的遗传分化。此外，宁波与杭州、绍兴、台州、金华等地区间也存在中等程度的遗传分化(FST>0.05)。因此，关于浙江省的东方蜜蜂群体，建议划分为浙北区、浙东区，以及其他区可能较为合适。在未来东方蜜蜂的资源保护工作中需要给予考虑。
单倍型系统发育分析显示，浙江省东方蜜蜂与周边亚洲大陆分布的东方蜜蜂更为接近，而与文莱、马来西亚的东方蜜蜂关系较远，这主要是由于海洋的隔离限制了东方蜜蜂的迁徙。印度的东方蜜蜂具有丰富的多样性，本研究的系统发育树也支持印度黄色东方蜜蜂独特的分类地位[27-28]。值得注意的是，浙江温州地区的东方蜜蜂单倍型H40与浙江其他地区的单倍型差异较大，而与印度的一个黑色东方蜜蜂样本高度相似，其可能的联系有待进一步研究揭示。特殊单倍型H40所在蜂群的生物学特性和生产性状也有待全面评价和进一步开发利用。
本研究基于较全面的浙江省东方蜜蜂样本，在448个样本中共发现46个单倍型，其中，新发现单倍型4个，说明全面深入的样本采集可以发现较多的单倍型，这在相关研究中也有发现[29]。我国东方蜜蜂分布较广，群体数量较大，且近几年数量增长较快，全面有代表性的样本对于我国东方蜜蜂遗传多样性的深入研究尤为重要。随着DNA测序成本的进一步降低，开展大样本量的研究也成为可能。线粒体DNA序列在蜜蜂遗传多样性研究中具有巨大优势，不同研究者不同地区间的样本数据非常方便进行合并分析。在我国各地进行全面深入研究的基础上，通过数据整合，未来有望获得我国东方蜜蜂遗传多样性的全面详细数据，从而为东方蜜蜂资源的保护和利用提供基础资料。
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