慢性饮水铅暴露对大鼠脑组织DNA,LigⅢ蛋白表达的影响及与氧化应激的关系
时间：2022-12-04 19:30:07 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
李炜娟 李小京 林少龙 任清风 任晓慧 徐群英 张中伟 肖元梅
(1南昌大学抚州医学院，江西 抚州 344000；
2南昌大学公共卫生学院)
铅可造成多系统多脏器的损伤，如心血管系统、生殖系统、免疫系统和神经系统。神经系统对铅比较敏感，微量铅暴露便可以引起神经系统的功能异常〔1〕。研究显示：铅诱导氧化应激损伤后，产生大量的活性氧自由基，这些自由基不稳定，可与DNA、蛋白质、脂质等大分子物质发生反应，使DNA单双链发生断裂，失去原来的结构与功能〔2〕。DNA连接酶Ⅲ是存在于真核生物中能够将两条DNA链连接起来的酶。在DNA单双链断裂修复、碱基切除修复中，DNA 连接酶Ⅲ通过与多种基因(如PARP1、XRCC1、PNK等)结合参与氧化应激损伤位点的修复〔3〕。目前，未见铅中毒对DNA 连接酶Ⅲ蛋白表达的报道。本研究通过分析饮水铅暴露大鼠脑组织连接酶Ⅲ蛋白表达水平及其与氧化应激之间的关系。
1.1主要试剂与仪器 三水合乙酸铅(西陇化工厂，分析纯)；
脑组织蛋白提取试剂盒(OMEGE公司)；
过氧化物酶(CAT)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基抑制活力(抑制OH-活力)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；
β-actin鼠抗(美国earthox)；
Anti-DNA LigⅢ兔抗(Abcam公司)；
二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；
多功能酶标仪(美国 Molecular Devices)；
铅标准溶液(国家标准物质研究中心)；
AA-6300C型石墨炉原子吸收分光光度计(日本岛津公司)；
AAS SOLAAR M6石墨炉原子吸收分光光度计(Thermo公司)；
722可见分光光度计(上海精密科学仪器公司)；
低温高速离心机(德国 Hettich)；
混匀器；
恒温水浴锅；
摇床；
电泳设备。
1.2实验动物分组及处理 40只刚断乳SPF级SD大鼠〔动物合格证号：SCXK(京)2012-0001〕，购自北京维通利华实验动物有限公司，体重90～100 g，适应性喂养1 w后，根据体重按随机区组法分为5个剂量组，分别饮用去离子水(对照组)、100 mg/L(最低剂量组)、200 mg/L(低剂量组)、400 mg/L(中剂量组)、800 mg/L(高剂量组)乙酸铅溶液，动物染毒60 d后处死并取脑组织，具体处理方法参照李炜娟等〔4～7〕的方法。
1.3检测指标及其方法 (1)Western印迹检测SD大鼠脑组织DNA LigⅢ蛋白的表达量：SD大鼠脑组织蛋白提取；
BCA法测定脑组织蛋白浓度；
电泳；
蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；
5%牛血清白蛋白(BSA)封闭；
加入一抗，4摄氏度过夜；
洗膜；
孵育二抗；
洗膜；
加入发光剂；
曝光；
定影。(2)大鼠血液及脑组织铅含量的测定；
(3)氧化应激指标：CAT、H2O2、抑制羟自由基能力(OH-)测定；
具体方法参照肖元梅、任清风的测定方法〔4～7〕。
1.4统计学分析 采用SPSS17.0软件进行方差分析、Pearson相关分析。
2.1不同染铅剂量组大鼠脑组织DNA LigⅢ蛋白表达水平比较 慢性饮水铅暴露后，低剂量组、中剂量组、高剂量组大脑皮质、小脑和海马中DNA LigⅢ蛋白表达量均明显低于对照组(P<0.05)，最低剂量组大鼠大脑皮质、海马DNA LigⅢ蛋白表达水平也明显低于对照组(P<0.05)，随着染铅剂量的增加DNA LigⅢ蛋白表达水平呈下降趋势，见表1。
2.2大鼠血液、脑组织中铅含量的变化 各染铅组大鼠血液、大脑皮质、小脑、海马铅的含量均高于对照组(P<0.05)，见表1。
表1 各组脑组织中DNA LigⅢ蛋白表达及铅含量比较
2.3大鼠脑组织氧化应激指标水平比较 染铅后，大脑皮质、小脑和海马CAT和抑制OH-活力均明显低于对照组，而H2O2水平明显高于对照组(P<0.05)，并随着染铅剂量的升高，脑组织CAT和抑制OH-活力呈逐渐下降趋势，而H2O2含量呈逐渐升高趋势(P<0.05)，见表2。
表2 不同剂量组脑组织CAT、H2O2、抑制OH-活力水平比较
2.4DNA LigⅢ蛋白表达量与血铅含量和氧化应激指标相关性分析 大脑皮质、小脑和海马DNA LigⅢ蛋白表达量均与脑铅含量呈负相关(P<0.05，P<0.01)，与CAT、抑制OH-活力呈正相关(P<0.01)，而与H2O2呈负相关(P<0.01)，见表3。
表3 DNA LigⅢ蛋白表达量与脑组织铅含量和氧化应激指标的相关性分析(r值)
三磷酸腺苷(ATP)依赖性DNA酶在真核生物中共有3种，分别为DNA LigⅠ、DNA LigⅣ和DNA LigⅢ，前2种主要分布于真核生物中，而DNA LigⅢ主要分布于脊椎动物种，它们在DNA的复制、断裂修复、损伤应答及基因重组过程中发挥重要作用〔8〕。DNA LigⅢ在碱基切除修复过程中发挥重要作用。氧化应激或碱基切除修复是造成DNA单链断裂最常见的损伤形式。体外研究证实：过氧化氢由细胞外进入细胞核内损伤DNA的方式有两种：一种是直接损伤细胞核内的DNA；
另一种是通过与二价金属离子结合生成氧化能力更强的羟自由基，生成的羟自由基使核酶活化，促使DNA链发生断裂〔2〕。本研究说明铅诱导神经系统发生氧化应激损伤。DNA LigⅢ通过与多个基因结合〔如X射线修复交叉互补蛋白-XRCC、多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-PARP、DNA聚合酶β-DNA polβ等〕参与氧化应激或碱基切除造成的DNA单链断裂的修复〔3〕。在哺乳动物中，DNA LigⅢ可以编码α和β两种剪切体，这两种剪切体的不同之处在于C-端〔9〕。DNA LigⅢαC-端含有一个BRCA1羧基末端结构域即BRCT结构域，DNA LigⅢβC-端是由17～18个氨基酸组成的细胞核定位信号〔10〕。DNA LigⅢαC-端的BRCT结构域可与XRCC1、PARP1结合。当DNA单链断裂损伤发生后，PARP1识别受损伤的缺口，随即被活化，活化的PARP1与单链断裂处解离，此时DNA LigⅢαC-端的BRCT结构域与XRCC1N-端的BRCT结构域结合，形成一个稳定的复合物，此异二聚体复合物置换PARP1，完成单链断裂的修复〔11～14〕。赵明星〔15〕研究显示，在DNA碱基切除修复过程中，DNA LigⅢα、XRCC1和DNA polβ三者可以两两形成复合物(DNA LigⅢα与XRCC1的亲和力高于DNA polβ)，参与DNA损伤位点的修复。Sallmyr等〔16〕研究显示，在患有慢性骨髓性白血病细胞中，DNA LigⅢ的表达量增加，同时发现DNA LigⅣ下降，选择性阻断DNA LigⅢ的作用可能是治疗癌症的一个手段。本研究说明铅通过诱导神经细胞氧化应激损伤而使DNA LigⅢ蛋白表达水平下降。
