内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊BMP2部分基因片段的克隆及分析
时间：2020-12-23 08:02:41 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
(内蒙古化工职业学院，内蒙古 呼和浩特 010010)
摘 要：从阿尔巴斯绒山羊及蒙古绵羊血中提取基因组DNA，根据已报道的BMP2基因的保守序列设计上下游引物，扩增山羊及蒙古绵羊的BMP2基因部分序列，将此片段克隆到pMD18-T载体中，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，并进行序列测定，并将两者序列进行比对。结果山羊该核苷酸片段与蒙古绵羊的同源性达99%，另与GenBank中人、小鼠、牛、绵羊的同源性分别为87%，85%，98%和99%。说明该基因在不同物种间具有较高的保守性，尤其是山羊与绵羊之间具有更高的保守性。
关键词：骨形态发生蛋白；
基因克隆；
序列分析
中图分类号：S827∶S826.8＋2 文献标识码：A 文章编号：1007—6921(2008)06—0064—03
绒山羊的皮肤和毛囊结构特征不仅是其生物学特征的重要内容，而且对其主要产品—绒毛产量和品质产生直接的重要影响。关于绒山羊绒毛生长机理的研究热点，尹俊、李长青、张燕军等在绒山羊的毛囊发育、生长周期及皮肤基因的表达作了大量的研究〔1～7〕。BMP（Bone Morphogenetic Protein）,即骨形态发生蛋白,是1965年Urist〔8〕对脱钙骨基质的成骨研究中发现的。BMP是一组能在骨骼外异位诱导软骨和骨形成的分泌型蛋白质,其组成不少于20种〔9〕。通过研究发现,BMP家族决定家畜不同时期的生长发育,骨骼形成,并且是毛囊发育涉及的信号分子之一。毛囊形态发生的起始信号源于真皮〔10〕，真皮细胞和上皮细胞之间相互作用，导致两个细胞群体的有序增殖和分化，并最终形成完整的毛囊〔11〕。最近已报道BMP2与小鼠次级毛囊的发生有关。关于绒山羊和蒙古羊毛囊发育与BMP2的关系还未见报道。本实验克隆绒山羊与蒙古羊BMP2基因片段，目的在于研究BMP2基因在绒山羊和绵羊毛囊发育过程中的表达情况，为进一步阐明绒毛生长的机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
阿尔巴斯绒山羊血液采自内蒙古阿白羊场，蒙古绵羊血液采自侯先志教授实验牧场。基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、载体pMD18-T、Ex taq DNA聚合酶、IPTG、X-gal、氨苄青霉素、Lambder DNA/EcoRI+HindIII、DL100均购于TakaRa公司。其他试剂皆为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA的提取方法。按照TakaRa公司血液基因组DNA提取试剂盒说明书基因组DNA ，灭菌三蒸水溶解，-20℃保存。
1.2.2 PCR引物的设计与合成。根据人、鼠、绵羊、牛的BMP2基因的保守序列，设计引物，由大连宝生物基因技术公司合成，引物序列如下：
F ：5 AAT AGC AGT TTC CAT CAC CGA ATT 3
R ：5 GAG GCG TTT CCG CTG TTT GT 3
1.2.3 PCR扩增条件。PCR反应的总体积为20μl，含1.5mMol/LMg2＋，10×buffer，50ng模板DNA，dNTP的终浓度为75μMol/L，引物终浓度为0.4μMol/L，2.5μTaqDNA聚合酶。PCR扩增条件：94℃ 5min，94℃ 1min，55℃ 1min ，72℃ 1.5min，循环30次，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 PCR产物的克隆。将PCR产物连接到pMD18-T载体，转化已制备好的E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB培养基平版上，37℃温箱培养16～20h。
1.2.5 阳性克隆的筛选和鉴定。挑取白色单菌落于10ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃,150rpm/min，振荡过夜。取20μl菌液快速筛选阳性克隆〔12〕，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。筛选滞后条带作为重组子，按质粒提取试剂盒操作说明提取质粒DNA，PCR鉴定，条件同上。
1.2.6 序列测定与分析。
将两个阳性克隆的菌液寄到上海生工生物工程公司进行测序。将获得DNA序列与GenBank数据库中公布的已知功能基因进行序列同源性比较以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
2 结果
2.1 阿尔巴斯绒山羊基因组DNA及BMP2基因部分外显子的扩增
基因组DNA在1.2%的琼脂糖胶中电泳（图1），条带清晰,没有拖尾。经分光光度计测OD260/280的值在1.6～1.8之间。
利用人和鼠BMP2基因同源序列设计上下游引物，设计梯度PCR从山羊基因组中扩增出了一条特异条带，测序结果为387bp与预期大小一致（图2）。
2.2 PCR扩增产物与T载体连接及其鉴定
PCR扩增产物连到pMD18-T载体上，经转化，利用重组子快速鉴定，筛选滞后重组子并提取质粒DNA，经PCR鉴定结果，得到目的片段（如图3），与预期结果一致。
2.3 测序及序列分析
2.3.1 阿尔巴斯绒山羊测序结果及序列分析。将筛选的阳性克隆进行测序,序列与GenBank数据库进行序列同源性比较，结果表明获得了绒山羊和蒙古羊BMP2基因基因片段。
2.3.2 绒山羊和绵羊BMP2扩增片段的分析。绒山羊BMP2与绵羊BMP2扩赠序列之间的比较,二者同源性达到99%，只有三个碱基不同(图4)。山羊该核苷酸片段与人BMP2同源区段的同源性87%，与小鼠的同源性85%，与牛的同源性98%。
2.3.3 绒山羊BMP2部分序列所编码蛋白质与绵羊及牛的比较。绒山羊、蒙古羊BMP2扩赠序列推导的氨基酸序列只有2个不同(图5),绒山羊和牛BMP2同源区段之间有4个氨基酸不同, 蒙古羊和牛BMP2同源区段之间有3个氨基酸不同。
3 讨论
由于BMP2是骨形态发生蛋白成员之一，属于TGF-β1超家族成员，属于相关信号通路信号分子，上皮-间充质间相互作用的一系列信号分子、信号通路及信号分子间相互作用实现了毛乳头细胞诱导、控制和调节毛囊的形态发生及维持毛囊的生长发育、周期性循环的作用。BMP2不仅具有促进软骨和骨组织形成的作用，而且证实对骨组织，脑组织，和脊髓组织的生长，发育，分化有重要的调节作用，并参与细胞凋亡和细胞信号转导的调节。本实验对羊骨形态发生蛋白2基因的部分外显子序列克隆，测序结果表明，此基因在不同物种之间具有较高的保守性，这对羊BMP2基因功能，调控研究有重要的意义，也为下一步羊BMP2全长基因的克隆、表达、以及基因功能研究奠定基础。国外在人和鼠毛囊发育、生长周期性变化的组织学形态方面作了深入的观察，在描绘控制人和鼠毛囊发育和周期的分子机制上已取得了较大的进展，毛囊在发育不同阶段和出生后不同周期之间的转化为毛囊角质化细胞和毛乳头成纤维细胞之间的双向信号交换所控制，似乎有很多生长刺激子和抑制子涉及调节控制毛囊发育和出生后周期活性〔13〕。因此，如何利用目前国外研究的毛囊的组织学和涉及控制毛囊发育和生长的分子信号途径的成果，将其应用于绒山羊的研究，用来改良绒山羊的生产性能和绒的品质是当前我们绒山羊育种的中心，也是今后绒山羊研究的主要方向之一。
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