人参归脾丸质量标准研究
时间：2023-06-19 22:45:01 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
李正刚 李本淳 王路宏 王丹彧 赵艳 马彧*
（1.四平市食品药品检验所 吉林 四平 136000；
2.吉林省药品检验研究院）
人参归脾丸由人参、黄芪（蜜炙）、当归、木香、茯苓等10味中药组成，具有益气补血、健脾养心之功效，常用于治疗心脾两虚、气血不足所致的心悸怔忡、失眠健忘、食少体倦、面色萎黄，以及脾不统血所致的便血、崩漏、带下等。其标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第四册[1]，现行标准仅收载了显微鉴别和当归薄层鉴别，无含量测定项，不利于质量控制。本文经前期文献调研[2-9]，建立处方中人参、当归和木香3味药材的薄层色谱（TLC）定性鉴别方法，并采用高效液相色谱法对黄芪甲苷的含量进行测定，以期为人参归脾丸的质量控制提供可靠的方法。
2.1 仪器与材料
电子天平（BT125D型，0.1 mg，北京赛多利斯仪器天平有限公司）；
HPLC-ELSD色谱仪（Agilent 1260型，配Agilent 1260 II型蒸发光散射检测器，美国Agilent公司）；
超声仪（KQ-500VDE型，昆山市超声仪器有限公司）；
硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限公司）。
黄芪甲苷（批号：110781-201717，纯度96.9%）、人参皂苷Rg1（批号：110703-201933）、人参皂苷Rb1（批号：110704-201928）、人参皂苷Re（批号：110754-202028）、人参（批号：120917-201712）、当归（批号：120927-201617）、木香（批号：120921-201309）对照品和对照药材（中国食品药品检定研究院）；
人 参 归 脾 丸 （批 号：20190801、20190901、20190902、20190903，吉林一正药业集团有限公司）；
乙腈（色谱纯，Flsher Scientific公司）；
甲醇、氯仿、正丁醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
水（超纯水）。
2.2 方法与结果
2.2.1 TLC定性鉴别
2.2.1.1 人参
取样品适量，研细，称取约15g；
加入甲醇150 mL，超声处理30 min，放置过夜；
超声处理30 min，滤过，取续滤液100 mL，蒸干；
加水30 mL使其溶解，移置分液于漏斗中；
蒸发皿用水5 mL洗涤，洗液并入分液漏斗中；
用氯仿提取3次，每次30 mL，弃去；
水层用正丁醇提取5次（40、40、30、30、20 mL），合并正丁醇液；
用氨试液洗涤3次，每次100 mL，弃去氨试液；
用水洗涤2次，每次80 mL；
正丁醇液蒸干，残渣加水15 mL使其溶解；
转移至D101型大孔吸附树脂柱上，用水60 mL洗脱；
用40%乙醇30 mL洗脱，用70%乙醇60 mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液蒸干；
用甲醇1.5 mL将残渣溶解，转移至2 mL量瓶中；
加入甲醇，稀释至刻度，作为样品溶液。
称取人参对照药材2.0 g，采用相同方法制备成人参对照药材溶液。称取人参皂苷Re、Rb1、Rg1对照品各2 mg，置于同一2 mL量瓶中，用甲醇溶解制成混合对照品溶液。按照人参归脾丸处方比例和工艺，制得人参阴性样品，再按样品溶液制备方法操作，制得人参阴性对照溶液。
吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲醇—氯仿—醋酸—水（6∶5∶0.5∶2）的下层溶液为展开剂，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃显色。结果显示，样品在与人参对照药材和人参皂苷Re、Rb1、Rg1对照品色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点，且人参阴性无干扰，典型色谱图见图1。
图1 人参TLC色谱图
2.2.1.2 当归
取样品适量，研细，称取约6 g；
加入氯仿50 mL，加热回流1h；
滤过，滤液蒸干，用甲醇1 mL溶解残渣，作为样品溶液。称取当归对照药材0.5g，采用相同方法制成当归对照药材溶液。按照人参归脾丸处方比例和工艺，制得当归阴性样品，再按样品溶液制备方法操作，制得当归阴性对照溶液。
吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯—正已烷（1：9）为展开剂，置于紫外光灯（365nm）下检视。结果显示，样品在与当归对照药材色谱相应的位置上，显现相同颜色的荧光斑点，且当归阴性无干扰，典型色谱图见图2。
图2 当归TLC色谱图
2.2.1.3 木香
取样品适量，研细，称取约6 g；
加入氯仿50 mL，回流1 h；
滤过，滤液蒸干，用甲醇1 mL溶解残渣，作为样品溶液。称取木香对照药材1 g，加甲醇30 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液。按照人参归脾丸处方比例和工艺，制得木香阴性样品，再按样品溶液制备方法操作，制得木香阴性对照溶液。
吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-正已烷（3∶10）为展开剂，喷以10%香草醛硫酸溶液，加热使斑点显色清晰。结果显示，样品与木香对照药材色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点，且木香阴性无干扰，典型色谱图见图3。
图3 木香TLC色谱图
2.3 黄芪甲苷含量测定
2.3.1 色谱条件
Zafex Supfex JX-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；
以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱；
洗脱程序：0～60 min，30%～30%A；
60～65 min，30%～50%A；
65～75 min，50%～90%A；
75～76 min，90%～30%A；
76～85 min，30%～%A；
流速：1.0 mL/min；
柱温：30℃。蒸发光散射检测器（ELSD）参数：雾化管温度：50℃，漂移管温度：90℃，载气流量：1.5 L/min，载气：氮气；
进样量：10 μL。
2.3.2 样品处理
2.3.2.1 对照品溶液制备
精密称取黄芪甲苷对照品10 mg，置于50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解，稀释至刻度，摇匀。
2.3.2.2 样品溶液制备
称取样品15 g（精确至0.000 1 g），精密加入含4%浓氨试液的80%甲醇溶液100 mL，密塞，称定重量；
加热回流2 h，放冷，称定重量；
用80%甲醇溶液进行补重，摇匀，滤过；
精密量取续滤液50 mL，回收溶剂至干，加水50 mL溶解残渣；
用正丁醇提取5次，每次50 mL；
合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次50 mL；
正丁醇液回收溶剂至干，用80%甲醇溶解残渣；
转移至5 ml量瓶中，即得。按照人参归脾丸处方比例和工艺，制得黄芪阴性样品，再按样品溶液制备方法操作，制得黄芪阴性对照溶液。
2.3.3 系统适应性试验
取“2.3.2”项各溶液，按照“2.3.1”项色谱条件进样测定，结果见图4。结果显示，黄芪甲苷与其他成分均达到基线分离，分离度均＞1.5，理论塔板数均≥10 000，阴性无干扰。
图4 液相色谱图
2.3.4 线性范围考察
精密称取黄芪甲苷对照品10.16 mg，置于20 mL容量瓶中；
用80%甲醇稀释至刻度，摇匀；
分别精密吸取2、5、7.5、10、15、20 μL注入液相色谱仪进行测定。以对照品进样质量m（μg）的对数lgm为横坐标，以色谱峰面积的对数lgA为纵坐标，绘制标准曲线。黄芪甲苷回归方程为：y=1.7649x+2.6111，r=0.999 8。结果表明，黄芪甲苷在0.985 μg～9.845 μg范围内，线性关系良好。
2.3.5 稳定性考察
取同一样品溶液，于0、1、4、8、16、24 h分别进行测定。结果显示，样品溶液在24 h内基本稳定，黄芪甲苷的RSD为2.6%。
2.3.6 重复性考察
取同一批号样品，平行制备6份样品溶液，同法测定，黄芪甲苷含量为103.3 μg/g，RSD为1.4%。
2.3.7 回收率考察
取已知含量的样品（批号：20190801）6份，每份约7.5 g，精密称定，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液100溶液（浓度7.49 μg/溶液），按“2.3.2.2”样品溶液制备方法，制成供试品溶液进行测定，回收率结果见表1。
表1 回收率试验结果（n=6）
2.3.8 样品测定
取4份不同批号的样品，按“2.3.2.2”项的方法进行处理，并计算含量，结果见表2。
表2 样品含量测定结果（n=2）
本文对样品回流提取时间进行了考察，分别考察回流1、2、4 h，结果分别为100.8、103.3、103.7 μg/g，可见回流2 h基本可以提取完全。经查阅文献[6-10]和实验考察，样品经过D101大孔吸附树脂的损失较大，在国产色谱柱和进口色谱柱均能达到有效分离的情况下，为确保实验准确，可以不进行过柱净化。
人参为人参归脾丸处方中的君药，对人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量亦进行了多种测定方法的考察，包括不同提取方法和液相检测方法，如HPLC-UV法和HPLC-ELSD法，阴性样品均有干扰。经查阅文献，未发现相关报道，故本文采用薄层色谱进行质量控制。
人参归脾丸是常用的中成药，属于国家医保目录产品，生产厂家众多。现阶段其临床研究报道较多，但质量标准研究较少，难以保证其产品质量，本文的研究成果可以为人参归脾丸的质量控制提供参考。
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