干扰素受体1沉默的人二倍体MRC⁃5细胞系对水痘⁃带状疱疹病毒复制的影响
时间：2023-03-23 17:25:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
杨骁，姜承瀚，孙博，谷铁军，万明明，孙捷，丁雪，王岑嵘，周恩同，姜皓，苏维恒
1.吉林大学生命科学学院艾滋病疫苗国家工程实验室，吉林 长春 130012；
2.延边大学农学院园艺园林系，吉林 延边朝鲜族自治州 133002；
3.吉林大学中日联谊医院手术室，吉林 长春 130033
水痘和带状疱疹是全球范围内广泛流行的两种疾病，均由水痘⁃带状疱疹病毒（varicella⁃zorter virus，VZV）引起［1］。VZV 是一种双链DNA 病毒，该病毒在人群中通过接触飞沫感染，通常初次感染于儿童时期，临床表现为水痘。水痘患者痊愈后，病毒会潜伏于患者神经节中，并有一定几率重新激活，导致带状疱疹。该疾病会导致不同程度的疱疹后神经痛，并且可能引起较为严重的并发症，甚至导致死亡［2］。
疫苗是防控VZV 的最好手段之一。自20 世纪60年代以来，基于细胞培养的疫苗逐渐成为病毒性疫苗的主要生产方式。可用于疫苗生产的细胞系包括原代细胞系（地鼠肾细胞、鸡胚细胞）、二倍体细胞系（人二倍体细胞、猴二倍体细胞）、传代细胞系（Vero细胞等）。目前常见的VZV 疫苗包括美国Merck 公司的 Varivax 和 Zostavax 以及英国 GSK 的 Varilrix等［3］。基于人二倍体细胞的生产模式，在安全性上优势明显，特别在去除疫苗中宿主细胞的DNA 污染上［4⁃5］。如 1995年批准上市的针对水痘的减毒活疫苗Varivax（Merck）和2006年批准上市的针对带状疱疹的减毒活疫苗Zostavax（Merck）均使用人二倍体细胞生产［6⁃7］。但人二倍体细胞培养技术难度较大，疫苗产量低，生产成本较高，造成疫苗价格昂贵，在发展中国家发展缓慢难以普及［8⁃9］。面对人二倍体细胞在疫苗生产中的困境，一些病毒疫苗选择使用非洲绿猴肾Vero 细胞生产，虽然增加了疫苗因非人DNA污染带来的安全隐患，但大幅提高了疫苗产量。如狂犬病病毒在Vero细胞中的复制水平较人二倍体细胞MRC⁃5高10倍左右［10］；
流感病毒在Vero细胞中的复制水平也显著高于人二倍体细胞［11］。但对于VZV，由于Vero细胞VZV受体的缺失，无法使用Vero细胞提高其疫苗产量，人二倍体细胞成为重要的VZV 减毒活疫苗生产细胞系。因此，探索病毒在人二倍体细胞中复制水平低的原因，寻找合适的方法提高病毒在人二倍体细胞中的复制水平，增加疫苗尤其是VZV减毒活疫苗产量，成为急需解决的问题。
1957年，科学家发现了一个非常重要的细胞因子——干扰素（interferon，IFN），不仅具有直接抗病毒作用，还具有免疫增强作用［12⁃14］。IFN 应答作为重要的先天免疫途径，主要通过识别病毒的特定特征而被激活，最终产生抗病毒因子，达到清除病毒的目的。病毒进入机体后，其不同于宿主的特点如双链RNA、三磷酸末端的 RNA、逆转录RNA 和CpG 被特定模式识别受体识别，激活IFNα／β表达［15］。IFNα／β分泌并被周边细胞的IFN 受体识别，激活细胞内部的IFN 信号传导，最终诱导产生如蛋白激酶RNA（protein kinase RNA，PKR）、2"，5"⁃寡腺苷酸合成酶1（2"，5"⁃oligoadenylate synthetase 1，OAS1）等病毒剪切因子［16⁃17］。通过细胞吞噬、病毒基因组剪切等方式，清除病毒［18⁃20］。IFN 应答的抗病毒机制抵御病毒入侵的同时，也成为基于细胞生产的疫苗发展的障碍。
如果克服了人二倍体细胞病毒疫苗产量低、价格高的劣势，将对我国基于人二倍体细胞病毒疫苗发展意义重大。本研究通过CRISPR／Cas9基因编辑技术构建 IFN 受体 1（interferon receptor 1，IFNAR1）沉默的 MRC⁃5 细胞系（MRC⁃5IFNAR1⁃），利用其提高VZV 的复制水平，为基于 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的疫苗生产模式奠定基础。
1.1 细胞、病毒及质粒 人胚肺成纤维细胞MRC⁃5、非洲绿猴肾Vero 细胞购自ATCC（American Type Culture Collection）；
VZV 减毒活病毒疫苗原液（voka株，病毒滴度为105PFU／mL）由长春百克生物科技股份公司提供，于-80 ℃保存；
质粒PX458、PX458⁃gRNA购自美国Addgene公司。
1.2 主要试剂及仪器 1%胎牛血清购自美国Gibco公司；
RNAprep pure 细胞总RNA 提取试剂盒购自中国 TIANGEN 公司 ；
MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、qPCR 试剂盒购自中国 TaKaRa Bio 公司；
PCR 操作系统CFX96购自美国Bio⁃Rad公司。
1.3 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的构建 通过对 MRC⁃5 细胞基因组IFNAR1（Gene ID：3454）区的分析，使用遗传扰动平台（Genetic Perturbation Platform，GPP）网络工具设计靶向的gRNA，并通过CRISPR 分析工具（CRISPR Analysis Tool，CAT）评估gRNA的切割效率。将gRNA克隆至含Cas9 蛋白序列的PX458 质粒中（克隆位点在U6启动子之后），电转（680 V）入MRC⁃5细胞，设原始细胞对照（MRC⁃5）组和PX458 空质粒电转对照（MRC⁃5NC）组；
电转后的细胞接种96 孔板，0.8个／孔，用含10%胎牛血清、1%青霉素⁃链霉素和1%L⁃谷氨酰胺的MEM 培养基，37 ℃，5% CO2条件下培养7~10 d，每3 d 更换新鲜培养基，培养过程中添加嘌呤霉素（0.6 μg／mL）。通过Sanger 测序（由库美生物科技有限公司完成）鉴定同基因敲除细胞克隆。测序结果中产生突变的MRC⁃5细胞被分离并传代最终形成3株原始的MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系。细胞系稳定传代5 次后，用RNAprep pure 细胞总RNA 提取试剂盒提取细胞总内源性mRNA，利用IFNAR1引物qRT⁃PCR法检测IFNAR1mRNA相对表达量。引物序列见表1，引物由库美生物科技有限公司合成。反应条件为：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，循环40次；
60 ℃ 30 s。所有反应设3个复孔，并使用2-△△Ct法量化。
1.4 MRC⁃5细胞的感染 将MRC⁃5或MRC⁃5IFNAR1⁃细胞接种6孔板，1.3 × 106个／孔，按0.1 MOI感染VZV，于32 ℃，5%CO2培养箱中孵育4 h；
无血清MEM 培养基洗涤细胞3次，用含1%胎牛血清的MEM培养基继续培养细胞。感染后24 和168 h 收集细胞和培养上清液，于-80 ℃保存。设原始细胞对照组（MRC⁃5和MRC⁃5IFNAR1⁃组），病毒感染组（MRC⁃5+和MRC⁃5IFNAR1⁃+组）。
1.5 VZV感染MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对IFN应答水平影响的检测 用RNAprep pure 细胞总RNA 提取试剂盒提取感染后24 h细胞总mRNA，利用IFNβ和OAS1引物qRT⁃PCR法检测IFN应答因子IFNβ和OAS1mRNA相对表达量。引物序列见表1，反应条件同1.3项。
1.6 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 VZV 基因组复制水平影响的检测 利用MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取病毒感染168 h后细胞培养上清中病毒DNA，利用 VZVORF62引物 qRT⁃PCR 法检测病毒 DNA 拷贝数。引物序列见表1，反应条件同1.3项。
表1 qRT⁃PCR引物Tab.1 Primers for qRT⁃PCR
1.7 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 VZV 子代病毒滴度影响的检测 采用空斑形成单位（plaque formation unit，PFU）试验。将病毒感染168 h 后细胞培养上清经10倍梯度稀释后，感染Vero 细胞，37 ℃，5%CO2条件下吸附4 h 后，覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散，通过统计空斑计算病毒滴度（PFU／mL）。
1.8 统计学分析 使用Prism 9 软件单向方差分析（ANOVA）进行统计学分析，组间比较采用t检验。所有试验重复3次，试验数据用均值±标准偏差（Mean±SD）表示。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1IFNAR1沉默的 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的鉴定MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系连续传 5 代后，对IFNAR1基因的测序结果显示，MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系含有稳定的移码突变，突变位点发生在IFNAR1IFNβ 结合域，这些移码突变是IFNAR1彻底沉默的前提条件，见图1。MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系IFNAR1mRNA相对表达量为MRC⁃5细胞的27%（t=24.50，P<0.01），为MRC⁃5NC细胞的24%（t=28.33，P<0.01），差异均有统计学意义，见图2。表明MRC⁃5IFNAR1⁃产生了IFNAR1基因的移码突变，并直接影响细胞内IFNAR1mRNA 的相对表达量，证明了MRC⁃5IFNAR1⁃的稳定性。
图1 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系测序Fig.1 Sequencing of MRC⁃5IFNAR1⁃cell line
图2 IFNAR1 mRNA相对表达量的qRT⁃PCR检测Fig.2 Determination of relative expression of IFNAR1 mRNA by qRT⁃PCR
2.2 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系生长状态观察 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系在细胞生长速度、细胞形态等方面与MRC⁃5细胞无明显差别，见图3。细胞传代至50 代左右，出现贴壁困难、生长缓慢、细胞代谢物增多、细胞死亡等现象。表明MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系极限代次与MRC⁃5细胞一致，IFNAR1基因沉默对 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的正常传代无明显影响。
图3 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系生长状态的显微镜观察Fig.3 Microscopy of growth state of MRC⁃5IFNAR1⁃cell line
2.3 VZV 感染 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 IFN 应答水平的影响 VZV 感染后24 h，与MRC⁃5组相比，MRC⁃5+组 IFN 应答水平显著增加，IFNβ和OAS1mRNA 相对表达量分别增加了92 和133 倍，差异有统计学意义（t分别为16.28和66.78，P均<0.01），见图4。同时VZV感染后24 h，与MRC⁃5+组相比，MRC⁃5IFNAR1⁃+组IFN应答水平显著降低，IFNβ和OAS1mRNA相对表达量分别降低了61%和90%，差异有统计学意义（t分别为18.82 和 16.75，P均<0.01），见图4。表明MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系有效沉默了病毒感染引起的IFN应答。
图4 病毒感染后 24 h MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系 IFN 相关基因相对表达量Fig.4 Relative expression of IFN related genes in MRC⁃5IFNAR1⁃cell line 24 h after virus infection
2.4 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 VZV 基因组复制水平的影响 VZV 感染后168 h，与MRC⁃5+组（2 600）相比，MRC⁃5IFNAR1⁃+组中VZV DNA 拷贝数（14 912）增加 5.7倍，差异有统计学意义（t= 10.51，P <0.01）。表明MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系 IFN 应答水平的降低有效增加了病毒在MRC⁃5细胞中的DNA复制水平。
2.5 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 VZV 子代病毒滴度的影响 VZV 感染后 168 h，与 MRC⁃5+细胞组相比（47 500 PFU／mL），MRC⁃5IFNAR1⁃+细胞组培养上清中VZV 病毒滴度（207 500 PFU／mL）增加4.3 倍，差异有统计学意义（t= 20.24，P <0.01）。表明IFNAR1沉默引起的低IFN 应答水平，提高了VZV 在MRC⁃5细胞中的产量。
近年来，基于细胞生产的疫苗成为全球预防病毒感染的最有效方法之一［21］。可以用于疫苗生产的细胞系很多，其中基于Vero 细胞生产的灭活病毒疫苗存在非人源DNA 污染物的安全问题。导致这种疫苗产品对质量控制中残留的DNA 要求极高［22］。对更安全疫苗的需求使采用人二倍体细胞如MRC⁃5细胞生产疫苗的策略意义重大［23］。但大多数病毒在人二倍体细胞中复制水平较低，THOULOUZE 等［24］报道了狂犬病病毒对二倍体细胞的感染效率仅为Vero细胞的30%。目前市售的VZV 疫苗多采用人二倍体细胞生产。研究表明，VZV 在MRC⁃5 细胞中的复制水平仅为 Vero 细胞的 1／5［25］。这导致疫苗成本高、产量低，在发展中国家的发展受到一定程度的制约。因此，如何提高病毒在人二倍体细胞中的复制水平，成为基于细胞生产的病毒疫苗的研究热点之一。
通过比较Vero 和MRC⁃5 细胞的不同，关注点集中到 IFN 应答系统上［26，12］。IFN 应答作为先天免疫系统重要的组成部分，其中Ⅰ型IFN 主要被病毒感染激活，行使抗病毒功能。其主要特点为对病毒识别的广谱性和抗病毒因子快速产生。IFN 应答的抗病毒作用可能在人二倍体细胞生产疫苗过程中变成阻碍，尤其是对一些感染早期病毒复制水平较低的病毒，如VZV 和甲型肝炎病毒（HAV）。通过抑制IFN应答的手段，提高这些病毒在人二倍体细胞中复制水平的研究较多。如 2003年，YOUNG 等［27］阐明了IFN 无应答细胞在疫苗开发和制造中的实际应用。2014年，STEWART 等［28］同样通过使用 IFN 抑制剂的方法增加了呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）在人二倍体细胞中的复制能力。HAMA⁃MOTO 等［11］通过使用 siRNA 沉默IRF7基因表达来增加MDCK 细胞中流感病毒的产量。使用抑制IFN应答手段提高VZV在人二倍体细胞中的复制水平研究较少，多数增加VZV 复制水平的研究仅关注毒种的筛选和病毒培养条件的优化［29⁃30］。但这些研究对于病毒复制水平的提高有限，因此，本研究采用抑制IFN 应答的方式来提高 VZV 在 MRC⁃5 细胞中的复制水平。
在对抑制IFN 应答手段的选择中，本研究面向生产考虑到传统IFN 抑制剂和siRNA 在生产应用中的缺陷，这些外源物质的加入难以在疫苗后续生产过程中去除，增加了质量控制的难度，并且将作为成本的一部分提高了疫苗价格。因此，本研究重点探讨IFN应答沉默MRC⁃5细胞系对病毒复制的影响。
本研究使用CRISPR／Cas9 编辑技术成功构建了IFNAR1沉默的 MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系。结果显示，CRISPR／Cas9编辑后IFNAR1基因发生了移码突变，且IFNAR1mRNA 相对表达量显著降低。这种降低可能是由无意义介导的mRNA降解（nonsense⁃mediated mRNA decay，NMD）或无终止密码子引起的mRNA降解（no⁃stop decay，NSD）导致的［31⁃33］。病毒感染后MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系 IFN 应答水平显著降低，VZV 在MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系中的 DNA 复制水平和子代病毒滴度均显著增加。这些结果均证明了MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系对 IFN 应答的有效沉默，提高了 VZV 在 MRC⁃5 细胞中的复制水平，为人二倍体细胞在疫苗生产中的应用提供了新的思路。
MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系的成功建立，解决了多种病毒在MRC⁃5细胞中产量低的问题。与同类研究抑制IFN 的方法如 IFN 抑制剂、siRNA 比较，减少了二次污染，使用方法更为简单。MRC⁃5IFNAR1⁃细胞系不需要改变传统的疫苗生产方法，明显节约了生产工艺的研发时间和成本，降低了质检检测压力。本研究为改进基于MRC⁃5细胞制备的病毒疫苗提供了新的思路和策略。
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