基于网络药理学与分子对接的蒺藜皂苷D抗肺纤维化的作用机制研究*
时间：2023-02-02 17:50:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
杨雪苗，薄彧坤，杨 丹，张淑宁，郭博宇，安 明1,
(1.蒙药药效物质与质量控制工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010000；
2.内蒙古科技大学包头医学院药学院；
3.内蒙古科技大学包头医学院2020级研究生)
肺纤维化是一种呈进行性、不可逆转性发展的肺间质性呼吸系统疾病，也是肺部疾病中高发病率和病死率的主要原因，具有多致病因素且病因未明的特点，是各种慢性肺部疾病的终末期病理特征。肺纤维化是因药物毒性、自身免疫性、感染性等因素[1]导致的肺组织结构破坏，后经人体自我异常修复产生瘢痕组织的结果[2]。肺纤维化的发生与炎性介质致肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞的募集、活化以及大量细胞外基质过度聚集有关[3]。目前尚未发现可以逆转肺纤维化的药物，只能通过改善其临床症状缓解纤维化进程，因此，探索可以抑制肺纤维化发展的有效药物迫在眉睫。
近年来，随着对肺纤维化研究的不断深入，利用中蒙药对肺纤维化进行治疗的研究逐渐增多。蒺藜(Tribulus terrestris L.)是蒺藜科的干燥成熟果实，已被用作中草药预防疾病数千年，常用于补肾、止咳、祛痰、明目和眩晕，可以治疗尿路感染、不孕症、阳痿等[4]。蒺藜皂苷D是蒺藜中提取分离出的一种甾体皂苷，具有广泛的药理作用，其可通过抑制神经传递介质与树突状细胞的相互作用，降低树突状细胞的成熟，下调炎症因子的表达水平[5]，还能通过诱导癌细胞周期阻滞和内皮细胞的凋亡发挥抗肿瘤和抗血管生成活性的药理作用[6]，因此，蒺藜皂苷D具有明显的抗炎和抗癌活性，但蒺藜皂苷D对肺纤维化保护作用的研究甚少。
网络药理学是一个相对较新的学科，它通过数据库及生物信息来阐明药物的分子相互作用，并且是研究复杂草药制剂作用机制的有力工具，已成功应用于研究中药制剂的作用机制，并通过了体外和体内验证。分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法，主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法[7]。本研究采用网络药理学和分子对接的研究方法，从分子水平上探讨蒺藜皂苷D治疗肺纤维化的作用机制，为蒺藜皂苷D治疗肺纤维化提供理论依据。
1.1数据库 本研究部分的实验数据是通过网络在线数据库获得，数据库具体名称的网址见表1。
表1 网络在线数据库名称及网址
1.2软件 操作系统：Windows 10 (64位)操作系统。Cytoscape 3.7.2：一个将蛋白-蛋白互作(PPI)
网络、ClueGO分析和蒺藜皂苷D-潜在靶点-疾病-通路网络可视化的软件，并将这些网络、注释与其他状态数据进行分析和可视化。Autodock：一个用于模拟小分子配体(活性成分)与大分子受体(潜在靶点)通过几何匹配和能量匹配产生相互作用的软件。Autodock具有对接速度快和对接质量高的优点，是分子对接领域应用较广泛的软件之一。PyMOL-2.5.2：是用于分子对接研究中对受体和配体进行预处理和将分子对接结果可视化的软件。
1.3方法
1.3.1靶点的收集 利用SwissTargetPrediction数据库收集已知的成分靶点。具体操作过程为：使用PubChem数据库查询蒺藜皂苷D的Canonical SMILES序列，然后导入SwissTargetPrediction数据库，Species选择Homo sapiens，结果筛选Probability>0的靶点作为蒺藜皂苷D的治疗靶点。为获得更多的药物靶点，通过PubMed数据库以“Terrestrosin D”为关键词进行文献检索以收集蒺藜皂苷D更多的潜在作用靶点。
以“pulmonary fibrosis”为关键词，在DrugBank数据库、GeneCards数据库和OMIM数据库中检索肺纤维化的相关疾病靶点，将3个数据库靶点合并，同时删除重复项，最终获得肺纤维化疾病靶点。
1.3.2韦恩(Venn)图的构建 获得蒺藜皂苷D作用靶点与肺纤维化作用靶点的交集靶点，并绘制Venn图，以筛选蒺藜皂苷D-肺纤维化共同靶点。
1.3.3PPI网络构建 基于STRING数据库构建PPI网络图。通过UniProt数据库将交集靶点名称进行标准化(gene symbol)，然后输入到STRING数据库中，Organism选择“Homo sapiens”，采用Cytoscape 3.7.2软件将PPI网络图可视化并使用“Network Analyzer”工具进行拓扑分析。
1.3.4靶点功能注释分析 利用Cytoscape 3.7.2软件中“ClueGO”工具对得到的交集靶点进行基因本体(gene ontology,GO)分析并对其功能进行注释，选择“Organism”为“homo sapiens”，设置阈值P<0.05。其中GO分析包括生物过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3个过程。
1.3.5靶点通路注释分析 为明确潜在靶点的作用途径，通过生物学信息注释数据库(DAVID)进行基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析，选择“homo sapiens”。为获得重要作用的信号通路，选取作用中重要性排名前15的信号通路通过微生信在线作图工具可视化KEGG网络。
1.3.6蒺藜皂苷D-靶点-肺纤维化-通路网络构建 将蒺藜皂苷D-肺纤维化的交集靶点及信号通路导入Cytoscape 3.7.2软件，构建蒺藜皂苷D-靶点-肺纤维化-通路网络图，并对其进行拓扑分析。
1.3.7分子对接 整合“1.3.3”中排名前8的核心靶点进行分子对接。采用AutoDock软件进行分子对接以模拟蒺藜皂苷D与肺纤维化相关信号通路中关键靶点的相互作用。配体小分子(蒺藜皂苷D)的三维结构(3D-SDF)由PubChem(PubChem CID:101995328)获得，通过PyMOL软件转化为PDB格式。受体(靶点蛋白)的三维结构文件由PDB蛋白结构数据库获得，为避免下载的蛋白晶体结构携带其他小分子配体和溶剂，导入PyMOL软件后将其去除并转化为PDB格式。分别将配体和受体PDB格式导入AutoDock软件，通过加入氢原子和去除水分子来优化结构，并保存为PDBQT格式文件。最后，运行AutoDock软件中“AutoDock Vina”程序对配体和受体进行分子对接。
根据配体小分子(蒺藜皂苷D)与受体(靶点蛋白)的结合自由能大小来评估二者的自发结合能力，最小结合能≤-5.0 kcal/mol被认为二者可以自发进行结合。将符合条件的分子对接结果导出并进行可视化。
2.1潜在靶点的筛选 通过查阅文献和数据库收集共获得43个与蒺藜皂苷D相关的作用靶点。删除重复项后，DrugBank、OMIM和GeneCards数据库共获得1 492个与肺纤维化相关的疾病靶点。
2.2Venn图的构建 将“2.1”获得的蒺藜皂苷D和肺纤维化相关靶点进行整合，获得二者共同作用的靶点17个，作为蒺藜皂苷D治疗肺纤维化的潜在靶点。通过在线网络绘制Venn图，见图1。17个潜在靶点包括HTR2B、HTR2A、CYP2D6、HTR1B、HSP90AA1、PSEN2、STAT3、VEGFA、FGF1、FGF2、VDR、LGALS3、MAPK3、IL6、PPARG、TNF和TGFβ1。
图1 蒺藜皂苷D-肺纤维化靶点Venn图
2.3PPI网络分析 为鉴定蒺藜皂苷D抗肺纤维化的中心靶点，采用Cytoscape 3.7.2软件构建了PPI网络并进行可视化。如图2所示，网络包含15个节点(靶蛋白)，58条边(蛋白间的相互作用)，聚类系数(Clustering coefficient)为0.715，平均节点度(Avg.number of neighbors)为7.733。根据度值(Degree)筛选对该网络贡献较大、作用较显著的靶点，度值排名前8的潜在靶点分别为MAPK3、PPARG、IL6、TNF、VEGFA、TGFβ1、FGF2和STAT3。节点越大、线条越粗，相应的颜色越深，表明其在该网络中的贡献程度越大。上述结果表明，蒺藜皂苷D可能通过多靶点的协同作用发挥抗肺纤维化的疗效。
图2 PPI网络图
2.4靶点功能注释分析 为更好地阐明蒺藜皂苷D对肺纤维化的保护作用，将“2.2”中获得的交集靶点进行GO富集分析。GO分析筛选得到BP条目418条，CC条目22条，MF条目29条。BP包括脂肪细胞分化的调节、脂质代谢过程的正向调节和对脂质生物合成过程的调节等；
CC包括免疫突触、小凹、白细胞介素-6受体复合物、血小板等；
MF包括RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合和生长因子活性等，重要过程展示见图3。
图3 GO功能富集结果图
2.5靶点通路注释分析 将“2.2”中获得的交集靶点通过DAVID在线数据库进行KEGG富集分析，共富集到69条信号通路，包括与信号转导相关的EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)和PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等；
与免疫系统(immune system)相关的有Th17细胞分化(Th17 cell differentiation)；
与神经系统(nervous system)相关通路有5-羟色胺能突触(Serotonergic synapse)；
本研究仅对影响显著的前15条通路进行展示，具体见图4，详细参数见表2。
图4 KEGG富集分析结果图
表2 KEGG通路富集信息
2.6蒺藜皂苷D-靶点-肺纤维化-通路网络分析 为进一步说明蒺藜皂苷D与肺纤维化间的相关性，使用Cytoscape 3.7.2软件构建了蒺藜皂苷D-靶点-肺纤维化-通路网络图(图5)。该网络由83个节点和293条边组成，其网络集中化(network centralization)和网络质性(network heterogeneity)参数分别是0.587和1.273。图中绿色节点表示肺纤维化，蓝色节点表示蒺藜皂苷D，黄色节点表示疾病与活性成分的交集靶点，红色节点表示交集靶点可能作用的信号通路，每条边表示活性成分与交集靶点之间的相互作用。
图5 蒺藜皂苷D-靶点-肺纤维化-通路网络图
节点的贡献和重要性通过Degree值和中介度值(Betweenness centrality)来评价。靶点MAPK3(Degree:11;Betweenness:1)、PPARG(Degree:11;Betweenness:1)、IL6(Degree:11;Betweenness:1)、TNF(Degree:11;Betweenness:1)、VEGFA(Degree:11;Betweenness:1)、TGFβ1(Degree:10;Betweenness:0.92)、FGF2(Degree:9;Betweenness:0.85)、STAT3(Degree:9;Betweenness:0.85)等具有较高的Degree值和中介度值，上述靶点主要参与了与肺纤维化相关的MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路等。以上结果表明，蒺藜皂苷D通过多靶点、多途径发挥抗肺纤维化的作用。
2.7分子对接 本研究中，FGF2、MAPK3、TGFβ1、TNF和IL6等核心靶点富集于MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路，结合PPI网络筛选出度值排名前8的潜在靶点MAPK3、FGF2、TGFβ1、TNF、STAT3、VEGFA、IL6和PPARG进行分子对接研究，并采用PyMol软件将对接结果进行可视化处理。蓝色背景代表各潜在靶点的结构，绿色代表蒺藜皂苷D结构，黄色代表蒺藜皂苷D与靶蛋白间的氢键。见图6，MAPK3与ARG-278、GLN-266、GLU-351、ASP-354、ASP-353残基形成氢键；
FGF2与LEU-57、LYS-67、GLN-55、ASN-105残基形成氢键；
STAT3与RHE-50、GLU-87残基形成氢键；
IL6与AGL-30、LYS-27、ARG-24、GLU-23、THR-20、LEU-19残基形成氢键；
PPARG与LYS-373、SER-380、PRO-378、GLU-388残基形成氢键。分子对接结果表明，蒺藜皂苷D可以靶向作用于MAPK3、FGF2、STAT3、IL6和PPARG等靶点发挥抗肺纤维化的作用。蒺藜皂苷D与各靶蛋白的对接的结合能见表3。
图6 分子对接结果图
表3 蒺藜皂苷D与核心靶点对接结果
本文是基于网络药理学结合分子对接的研究方法探究蒺藜皂苷D抗肺纤维化的作用机制。通过度值大小筛选出MAPK3、PPARG、IL6、TNF、VEGFA、TGFβ1、FGF2和STAT3等靶点为蒺藜皂苷D治疗肺纤维化的关键靶点。TNF-α作为一种重要的致炎因子，能活化巨噬细胞和单核细胞，促进胶原纤维的过度增生和细胞外基质的分泌，加速肺纤维化病理进程，同时TNF-α可刺激其他炎症因子的表达，增强成纤维细胞的增殖，胶原的合成[8]。在肿瘤发展中TNF-α可增强TGF-β的表达，TGF-β在脏器纤维化过程中扮演着重要角色，TGF-β的激活是间质增生的诱因，是肺纤维化炎症反应向纤维化病理过程转变的关键介质，在纤维化中发挥“总开关”作用。TGF-β1可以刺激细胞增殖和活化，分泌大量的胶原纤维等细胞外基质成分促使脏器发生纤维化[9]。张娜等[10]通过体外实验用TGF-β1诱导人肺成纤维细胞间质纤维化，表明TGF-β1是肺纤维化的诱因之一。VEGFA是血管生成剂之一，肺纤维化的发生伴有血管生成异常的现象和VEGFA蛋白表达的增加。因此，抑制VEGF的激活可以缓解肺纤维化的发生进程[11]。
在肺纤维化发展过程中，脂质代谢的稳态会被破坏。正常细胞大多数依靠从血流中摄取脂肪酸和脂蛋白来满足其脂质需求，而异常细胞会重新激活脂质生物合成，以促进细胞膜的生成，并支持其生长增殖，最终导致脂质合成及代谢异常。GO富集结果表明，蒺藜皂苷D发挥治疗肺纤维化的药效机制可能与脂肪细胞分化的调节、脂质代谢过程的正向调节和对脂质生物合成过程的调节等生物过程有关。
PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路是肺纤维化发生发展中重要的信号转导通路。PI3K-Akt信号通路是调控细胞自噬过程的重要途径，而肺纤维化被认为伴有自噬现象，肺组织损伤后会进行修复，局部活化的肺成纤维细胞会分泌胶原蛋白完成组织修复，之后基质胶原蛋白收缩产生刺激信号诱导肺成纤维细胞发生凋亡，从而避免肺成纤维细胞过度增殖、胶原蛋白异常沉积，阻止肺纤维化的发生。现有证据表明，TGF-β和PI3K-Akt的相互作用促进肺纤维化的形成[12]。MAPK信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，广泛分布于哺乳动物细胞中，该通路在炎症、肿瘤等一系列疾病的病理生理过程中发挥重要作用，此外，其在许多主要器官的纤维化过程中发挥重要作用，如心肌纤维化、肾纤维化和肺纤维化[13-14]。TGF-β、TNF-α等细胞因子的生成与MAPK信号通路的激活有密切联系，MAPK信号通路的激活又会促使各细胞因子的大量生成，从而加速肺纤维化的发展[15]。
综上所述，通过网络药理学结合分子对接的方法显示，蒺藜皂苷D可能通过MAPK3、FGF2、TGFβ1、TNF、STAT3、VEGFA、IL6、PPARG等靶点作用于EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等，发挥抗炎、抗肺纤维化的药理作用；
蒺藜皂苷D与受体MAPK3、FGF2、STAT3、IL6和PPARG的结合活性较高。蒺藜皂苷D治疗肺纤维化通过多靶点、多途径发挥作用，该研究为蒺藜皂苷D治疗肺纤维化的深入研究提供了理论基础。
