大蒜素改善PM2.5致HUVEC氧化应激和凋亡
时间：2023-01-26 14:45:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
薛盼盼， 刘远凤， 姜小军， 封少龙
(1.南华大学衡阳医学院公共卫生学院，湖南省衡阳市 421001；
2.桂林医学院公共卫生学院预防医学研究所，广西壮族自治区桂林市 541199)
大量流行病学研究表明细颗粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)暴露与心血管疾病密切相关，即使是低水平的PM2.5暴露仍可影响心血管系统健康[1-4]。因此，发展药物或食物来保护居民心血管健康具有重要意义。
大蒜素是大蒜的一种生物活性成分[5]，流行病学调查显示，中国华北地区大气PM2.5平均水平相对较高，但因PM2.5暴露引发的心血管疾病发病率和死亡率并未高于其他地区[6]，可能与该地区人们生活习惯(每天摄入较多的大蒜)有关。本研究探讨大蒜素保护人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)免受PM2.5介导的氧化应激和凋亡的机制，为预防或减轻PM2.5对心血管健康的危害提供新的食物干预策略。
1.1 试剂和仪器
PM2.5样本由中国科学院广州地球化学研究所提供，HUVEC来源于南华大学衡阳医学院心血管疾病研究所。DMEM培养液购自Gibco公司(USA)；
酶标仪购自美国Bio-Rad公司；
荧光分光光度计购自美国赛默飞公司；
倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司；
CCK8试剂盒和Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒购自日本Dojindo公司。活性氧(reactive oxygen species，ROS)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。总GSH检测试剂盒和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。FastPureCell/Tissue总RNA提取试剂盒、HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒和2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。p53、磷酸化p53(p-p53)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2-associated X的蛋白质(Bcl-2-associated X，Bax)、多聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)、活化的PARP(cleaved poly-ADP-ribose polymerase，cleaved PARP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9(Caspase-9)、活化的Caspase-9(cleaved Caspase-9)、Caspase-3、cleaved Caspase-3和细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗体购自美国CST公司；
核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、Kelch样环氧氯丙胺相关蛋白1(Keap-1)、HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG抗体购自美国Proteintech公司；
磷酸化Nrf2(p-Nrf2)抗体购自美国Abcam公司。
1.2 细胞分组及培养
细胞分为对照组、PM2.5组、大蒜素组、大蒜素联合组。对照组不做任何处理，用配制好的新鲜DMEM培养液进行培养；
PM2.5组培养液为PM2.5悬液加入新鲜DMEM培养液中，使PM2.5组培养液的终质量浓度为5 mg/L；
大蒜素组培养液为大蒜素粉末加入新鲜DMEM培养液中，使大蒜素组培养液的终质量浓度为10 mg/L；
大蒜素联合组用5 mg/L PM2.5组培养液与10 mg/L大蒜素组培养液一起处理细胞。各组处理时间均为24 h。
1.3 CCK8试剂盒测定细胞活力
将HUVEC(104个细胞/孔)接种到96孔板中，待细胞生长至对数期后，按不同组别的因素处理细胞24 h。随后，在96孔板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液孵育1～3 h后，酶标仪在450 nm处检测细胞光密度值。根据光密度值制作生长曲线检测细胞活力。
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡
采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒测定凋亡率。各组按凋亡试剂盒说明书处理后，1 h内完成流式细胞仪检测。
1.5 ROS、GSH、总GSH、MDA、MMP和抗氧化酶水平测定
将HUVEC接种到培养皿后，待细胞生长至对数生长期，进行不同组别处理，24 h后收集细胞。使用ROS、GSH、总GSH、MDA、MMP以及相关抗氧化酶检测试剂盒测试细胞内抗氧化酶和代谢物的水平。
1.6 qRT-PCR测定mRNA表达水平
使用FastPureCell/Tissue总RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA，用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒测定靶基因(引物序列见表1)cDNA拷贝数。通过2-ΔΔCt方法计算靶基因相对mRNA表达水平。
表1 引物序列
1.7 Western blotting测定蛋白表达水平
蛋白裂解缓冲液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白水平，调整蛋白水平，加入上样缓冲液，煮沸10 min后聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜，室温下5%脱脂奶粉封闭。将附有蛋白质的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)用TBST溶液洗涤3次，4 ℃一抗孵育过夜，然后二抗孵育1 h。最后使用增强型化学发光试剂盒在化学发光成像系统进行显影。
1.8 统计学分析
2.1 大蒜素对HUVEC活力的影响
与对照组比较，PM2.5组细胞活力降低；
与PM2.5组比较，大蒜素联合组细胞活力增加(P<0.05；
图1)。
图1 大蒜素对HUVEC活力的影响a为P<0.05，与对照组比较；
b为P<0.05，与PM2.5组比较。
2.2 大蒜素对PM2.5诱导HUVEC凋亡的影响
与对照组比较，PM2.5组细胞凋亡率p-p53/p53、cleaved Caspase-9/Caspase-9、cleaved Caspase-3/Caspase-3和cleaved PARP/PARP升高，Bcl-2/Bax表达降低(P<0.05；
图2)。与PM2.5组比较，大蒜素联合组凋亡率降低，p-p53/p53、cleaved Caspase-9/Caspase-9、cleaved-3/Caspase-3和cleaved PARP/PARP的表达降低，Bcl-2/Bax表达升高(P<0.05；
图2)。
图2 大蒜素对PM2.5诱导HUVEC凋亡的影响A为各组流式细胞图；
B为各组细胞凋亡柱状图；
C为各组蛋白条带；
D为各组相对蛋白表达柱状图。a为P<0.05，与对照组比较；
b为P<0.05，与PM2.5组比较。
2.3 大蒜素对HUVEC MMP的影响
与对照组比较，PM2.5组线粒体JC-1聚集体产生的红色荧光减弱(图3A)，Cyt C蛋白表达增高(P<0.05；
图3B、C)。与PM2.5组比较，大蒜素联合组线粒体JC-1聚集体产生的红色荧光增强(图3A)，Cyt C蛋白表达降低(P<0.05；
图3B、C)。
图3 大蒜素对HUVEC MMP的影响A为MMP的荧光图(荧光染色，200×)；
B为Cyt C的蛋白条带；
C为Cyt C蛋白表达水平柱状图。a为P<0.05，与对照组比较；
b为P<0.05，与PM2.5组比较。
2.4 大蒜素对HUVEC氧化应激的影响
与对照组比较，PM2.5组ROS和MDA水平增加，GSH/总GSH的比例和抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-PX)活性降低。与PM2.5组比较，大蒜素联合组ROS、MDA水平降低，GSH/总GSH的比值和抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-PX)活性升高(表2)。
表2 大蒜素缓解PM2.5对细胞内ROS、GSH/总GSH、MDA、CAT、SOD、GSH-PX水平的影响
2.5 大蒜素对Keap-1/Nrf2信号通路蛋白表达水平的影响
与对照组比较，PM2.5组Keap-1蛋白表达增加，p-Nrf2/Nrf2蛋白表达降低(图4)，抗氧化酶基因(CAT、SOD、GSH-PX和GPX4)的mRNA表达降低(P<0.05；
表3)。与PM2.5组比较，大蒜素联合组Keap-1蛋白表达降低，p-Nrf2/Nrf2蛋白表达升高，抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-PX和GPX4)mRNA表达增加(P<0.05；
表3)。
图4 Western blotting检测细胞内的Keap-1、Nrf2蛋白表达
表3 Keap-1和p-Nrf2/Nrf2相对蛋白表达水平及抗氧化基因CAT、SOD、GSH-PX、GPX4的相对mRNA表达水平
心血管内皮细胞对维持心血管系统的正常生理功能具有至关重要的作用[7-10]。而PM2.5暴露诱导内皮细胞凋亡可能是促进动脉粥样硬化及其并发症的关键病理过程[11-13]。大蒜素具有抗癌、抗神经变性和改善脂质代谢作用[14-16]，但大蒜素保护PM2.5介导的内皮细胞凋亡的分子机制尚未研究清楚。
本研究结果表明，大蒜素能够降低p53的磷酸化水平、下调cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP的蛋白活化形式，增加HUVEC中的Bcl-2蛋白、Caspase-9、Caspase-3和PARP的酶原形式，表明大蒜素能够通过阻断细胞内凋亡途径的信号转导来保护心血管细胞免受PM2.5介导的凋亡作用。此外，大蒜素可以降低氧化应激，降低细胞内ROS和MDA水平，增加HUVEC中GSH/总GSH的比率，且能够有效上调Nrf2蛋白表达并促进其磷酸化，增强下游抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-PX和GPX4)mRNA表达并增加其活性。同时，大蒜素能够减轻HUVEC中PM2.5暴露导致的线粒体功能障碍和损伤，保持MMP并阻止细胞色素C释放到细胞质中。
综上所述，大蒜素可通过阻断细胞内凋亡通路的信号转导来保护HUVEC免受PM2.5介导的细胞凋亡，还可以通过多种抗氧化机制降低HUVEC中PM2.5介导的氧化应激，防止PM2.5暴露对人体心血管系统造成的损伤。
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