太赫兹刺激听神经的测试平台搭建
时间：2023-01-24 11:50:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
谭晓轩 杨 霄 陈 硕 尹俊凯 冯逸飞 袁一方 吴开结
（1）国防科技创新研究院太赫兹生物物理学创新工作站，北京 100071；
2）中国航天员科研训练中心，北京 100094）
太赫兹（terahertz，THz）波介于微波和红外之间，是电子学向光子学过渡的特殊区域。20 世纪90年代之前，太赫兹波段两侧的微波和红外的研究相对已较成熟，但是由于缺乏太赫兹波段的发射源和检测技术，这一波段一直被称为“太赫兹间隙”。随着光学太赫兹技术在高频段太赫兹波研究中取得的巨大进步，以及微波技术向低频段太赫兹波研究中的延伸，太赫兹源与检测技术均取得了突破性的进展，太赫兹波的应用也迅速扩展到了航空航天、环境科学、生物医学等多个领域，尤其在生物医学领域，太赫兹波作为战略性资源，将对生命科学和临床医学产生重大贡献。与其他波段的电磁波相比，太赫兹波具有瞬态性、宽带性、低能量性、对非极性物质的高穿透性和极性分子的高吸收性等优势。生物大分子的转动和振动频率大多位于这一频段内，根据这一特性发展出来的太赫兹光谱分析技术已经在生物医学检测领域得到了广泛的应用［1-2］。在分子层面，由于极性分子对太赫兹波具有强烈的共振吸收，因此太赫兹波可用于检测不同极性的氨基酸分子、DNA等信息［3］；
在组织层面，可利用太赫兹波对水分敏感的特性检测病变组织并辨别病变区域的大小和形态［4］；
在器官层面，太赫兹波可有效检测龋齿等器官病变［5］。
而在神经调控领域，太赫兹技术仍处于起步阶段。电磁波谱中其他波段电磁辐射与生物体的相互作用已有多年研究历史，作为最后一个被发现的电磁波段，太赫兹波在未来有着极大的应用空间［6-8］。太赫兹波特殊生物效应的利用将成为重要的研究领域，而神经效应的研究则是重中之重。由于神经效应的复杂性，以太赫兹波为主的电磁辐射引起的神经系统应答目前仍处于未知阶段。麦克斯韦方程组的提出极大促进了电磁场的研究，然而关于生物组织特别是神经组织电磁特性的研究相对不足。有学者提出，生物神经信号的物理场应为太赫兹到红外的高频电磁场，最可能频率范围应在THz 到百THz，生物神经中电磁信号的产生、传输和耦合等是微纳尺度上的，有些甚至是单分子结构水平上的，应符合电磁场和量子理论［9］。但一直以来，从分子、细胞到在体层面的电磁场活动及其作用尚未得到充分研究。内源性太赫兹波等高频电磁信号神经通讯或生理信号转导机制则成为了更具颠覆性的值得验证的科学假说［10-13］。太赫兹波等高频电磁信号的神经机制或神经效应的发现和阐明，将成为脑科学领域颠覆性突破，将对生命科学基础理论产生重构性的影响，并引导众多生物医学学科的研究思路和技术方法变革。然而，要比较准确地研究太赫兹辐射与神经组织相互作用的机理以及指导未来采取医学防护的措施，除了理论计算外［14-15］，还需要大量的在细胞、组织、在体等不同层面的实验。基于这些需要，设计一些可以比较科学地测试不同强度、不同方式太赫兹辐射效应的实验装置，同时结合传统神经科学检测手段的实验系统十分必要。
1.1 细胞测试实验系统
该系统主要包括可调频太赫兹激光器、光束整形单元、多维度微调平台和细胞培养箱等，其中，可调频太赫兹激光器用于产生太赫兹波段的高频电磁脉冲，光束整形单元用于将太赫兹波扩束、整形并聚焦至细胞培养皿底部（反射镜：金镜，扩束器：GBE10-E3，Thorlabs），多维度微调平台用于调节细胞培养皿位置，将目标区域和光斑微调对准，细胞培养箱放置在辐照系统旁边，方便细胞的取放和活性的维持，细胞培养皿放置在多维度微调平台上，光束经45°反射镜后辐照到细胞培养皿底部，功率可达500 mW，光斑大小可根据实验需求利用光束整形单元进行调节。细胞测试系统基本装置如图1，2所示。
1.2 膜片钳电生理-太赫兹联合检测系统
该系统主要包括可调谐高峰值功率太赫兹辐照系统和膜片钳电生理检测系统。其中可调谐高峰值功率太赫兹辐照系统包括可调频太赫兹激光器、光束整形单元、光纤耦合器、多维度微调平台和光纤，可调频太赫兹激光器和光束整形单元的作用与细胞测试实验系统一致，光纤耦合器用于固定光纤输入端，多维度微调平台用于调节光纤耦合器位置，将光纤输入端和光斑微调对准，从而控制输出功率，光纤输入端接收太赫兹波，光纤输出端将太赫兹波导入生物细胞或组织，光纤为柔性光纤，因此刺激靶点改变具有很好的灵活性。光纤位置和电生理检测用电极的位置分别用不同电机控制（图3），可以根据目标细胞灵活调节两者之间的相对位置，将可调谐高峰值功率太赫兹辐照系统和膜片钳电生理检测系统进行了一体化联合和集成，可以实时检测辐照前后神经组织的各项生理活性。
Fig.1 Physical photo of cell testing system
Fig.2 Schematic diagram of terahertz optical path
1.3 双光子-太赫兹联合在体检测系统
该系统主要包括可调谐高峰值功率太赫兹辐照系统和在体双光子检测系统。可调谐高峰值功率太赫兹辐照系统与膜片钳电生理-太赫兹联合检测系统一致，包括可调频太赫兹激光器、光束整形单元、光纤耦合器、多维度微调平台和光纤。本课题组沿用了经典的双光子成像系统，在不改变光路结构的前提下，将太赫兹光纤直接从电磁屏蔽罩上引入小鼠头部暴露位置，太赫兹光纤、小鼠固定装置和透镜分别由不同的电极控制，可以随意调节水平位置以及成像深度（图4a）。还设计了小鼠头部固定的专用装置，可以将清醒状态下小鼠皮层抖动降至最低。图4b 为大尺度成像视野下转基因小鼠神经元接收辐照时的实物图。
Fig.3 Physical photo(a)and schematic diagram(b)of patch-clamp electrophysiology-terahertz joint detection system
Fig.4 Physical photo of two-photo-terahertz joint detection system in vivo
1.4 听觉脑干反应（auditory brainstem response，ABR）-太赫兹联合检测系统
该系统主要包括可调谐高峰值功率太赫兹辐照系统和ABR 检测系统。可调谐高峰值功率太赫兹辐照系统与膜片钳电生理-太赫兹联合检测系统一致，包括可调频太赫兹激光器、光束整形单元、光纤耦合器、多维度微调平台和光纤。ABR 测试使用的是传统的听觉脑干反应测试系统，使用听觉电生理测量装置（TDT system，USA）来记录并测量ABR。每次使用前进行声音强度校准，一个麦克风（Model 7016，ACO Pacific，Ⅰnc.，USA）接收到声音信号并转换成电信号，由TDT 系统采集并传送到计算机，经计算确定实际声压级。使用闭合声场来播放声音，声音由扬声器EC 1 发出，并通过一根聚合物材料制成的细管将声音传送到动物耳朵，太赫兹波由光纤导入豚鼠耳蜗（图5）。
Fig.5 Physical photo of ABR-terahertz combined detection system
2.1 细胞检测系统
太赫兹波与DNA、RNA、蛋白质等重要生物大分子的转动和振动能级最为吻合。根据“中心法则”，太赫兹波与生物大分子的相互作用结果，终将影响细胞乃至组织的功能和结构，产生太赫兹波独有的生物效应。通过对使用该系统辐照后的细胞进行病理或生理上分子水平的检测，可以获得生物样品经太赫兹波作用后本身的变化，获得生物性质变化指标，以研究太赫兹生物效应及其安全性或开发特殊的应用方式，并且可以为神经通讯、生理信号转导机制的研究提供实验依据。
2.2 膜片钳联合检测系统
由于膜片钳系统对电磁屏蔽要求较高，为了验证膜片钳电生理-太赫兹联合检测系统的工作能力，本文首先测试了系统噪音。该实验使用野生型C57小鼠（雌雄随机），实验小鼠年龄为2～3个月。腹腔注射麻醉剂戊巴比妥钠（注射量：10 mg/kg），深度麻醉后（无足痛反应），迅速断头取脑并置于预冷至0℃的人工脑脊液中，使用振动切片机（VT-1200s Leica）将脑组织切片，脑薄片厚度为250 μm，切片完成后，立即将切片转移至充分充氧的人工脑脊液中进行孵育，孵育温度为34.5℃。时间为45～60 min，之后置于室温待记录。使用电压钳模式（图6），将神经元膜电位控制在静息电位-70 mV 附近，记录了10 s 神经元的膜电位。实验结果表明，联合检测系统记录到的神经细胞的电信号和电学性质不会被噪音淹没。
Fig.6 Cell membrane potential recorded when the terahertz laser is switched on
接下来使用该系统测试了太赫兹辐照对脑片中神经元兴奋性突触后电流的影响，分别记录了辐照前（黑色部分）和辐照时（红色部分）的兴奋性突触后电流的发放情况（图7），可见系统能稳定长时间记录辐照前后电流发放的信号并比较辐照对神经信号产生和传导的影响。
Fig.7 Excitatory postsynaptic currents in neurons before(black)and after(red)terahertz irradiation
2.3 双光子联合检测系统
该实验在普通C57 小鼠上进行（雌雄随机），实验小鼠年龄2～3个月。通过体外注射带有钙指示剂GCaMP的AAV病毒到目标区域对神经元进行标记。在病毒携带的基因表达后，用钙成像的方式对神经元进行钙活动记录，图8为小鼠在辐照前、辐照时（橙色阴影部分）、辐照后自发活动的对比。可以看到，此双光子-太赫兹联合在体检测系统可以实时探测太赫兹波对神经元钙活动影响的瞬时变化，反映太赫兹刺激对神经活动的影响［16］。
Fig.8 Calcium signal release during terahertz irradiation(between the red dotted lines)[16]
2.4 听觉脑干反应检测系统
该实验在普通成年豚鼠上进行（雌雄随机），体重250～350 g。首先进行豚鼠耳后开窗手术，然后进行ABR 测试。测试前首先将豚鼠麻醉（腹腔注射2%戊巴比妥钠0.1 ml），确认动物处于麻醉状态后，将动物置于加热垫上，在动物双耳中点、耳后和大腿内侧皮肤下分别插入记录电极、参比电极和接地电极，确保电极电阻小于1 KΩ。原始信号ABR采样率为25 kHz，记录300～3 000 Hz的信号。在实验过程中，对动物的呼吸、心跳、体温等生命体征进行监测，以确保动物处于正常状态，每个刺激连续进行512次，以提高平均信噪比。所有的操作均在电磁屏蔽的隔音室中进行。由实验结果得出，该系统的ABR 采集效果良好，成功得到了辐照期间豚鼠的ABR 信号（图9），可以检测太赫兹辐照对动物听力阈值的影响，符合实验研究的要求。
Fig.9 ABR test results before and after irradiation
当前国内外针对电磁场的生物效应研究主要集中在以微波、毫米波为代表的低频电磁场和以红外为代表的高频电磁场所产生的对模式动物影响的实验研究［17-19］，而几乎所有的生物分子的转动和振动跃迁都在介于毫米波和红外之间的太赫兹波频段表现出强烈的吸收和色散［20-22］。目前，国际上很多国家如美国、日本、俄罗斯等已经开始着手太赫兹辐射的生物效应装置、系统或样机的研究，应用对象包括细胞、组织、动物等［23-25］，以期突破太赫兹辐射源技术和辐射条件对太赫兹生物效应研究的限制，但均还处在初级阶段。中国整体太赫兹技术和太赫兹应用研究起步较晚，设计制作以太赫兹为主的电磁辐射装置，研究太赫兹刺激对神经系统的影响，将对神经科学领域和医疗科技带来突破性的进展。
本文利用自主搭建的可调谐高峰值功率太赫兹辐照系统，分别在细胞、组织和在体层面研制了太赫兹生物效应检测系统，均已投入使用，经实验测试可以有效地在不同尺度上检测太赫兹波对神经系统不同生理活动的影响［16，26］。实验结果证实，该系统设计精巧、操作简单，而且应用广泛，不仅可以应用于神经系统的测试，还可以根据需求测试太赫兹波对其他组织（例如皮肤、血液、心肌细胞）的影响，有利于解析太赫兹波对不同生命活动的效应，以此探寻太赫兹波对生物多功能集群的影响。
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