一起猪2型链球菌的分离鉴定及诊疗
时间：2023-01-24 08:50:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
黄中善 黄文炳 梁家绥
（1.南宁市宾阳县动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530400；
2. 广西悦牧生物科技有限公司，广西 南宁 530007）
链球菌（Streptococcus）是重要的人畜共患传染病病原菌，可感染人以及猪、牛、羊等多种动物，其主要传播方式为经口、呼吸道及破损的皮肤伤口感染，也可垂直传播。［1］链球菌属球菌科、链球菌属、革兰氏阳性兼性厌氧菌。猪链球菌（Streptococcus suis）对各种品种猪群、不同年龄及性别的猪均易感，可引起脑膜炎、关节炎、败血症、多发性浆膜炎、肺炎和急性死亡等［2，3］，是世界范围内养猪业最常见的细菌性疾病之一，危害着生猪养殖业的健康发展。更为重要的是，猪链球菌能够通过伤口或猪产品感染人，引起人脑膜炎、败血症等重要的疾病［4］，对相关从业人员的身体健康和公共卫生构成严重威胁。
目前，根据链球菌荚膜多糖抗原的差异，可将其分为35个血清型，即1~34及1/2型。［5］对猪具有较强致病性的主要血清型有1型、2型、7型和9型，其中血清2型致病力最强［6］，危害最为突出。本试验采集广西宾阳县某规模化猪场2021年6月发生的疑似猪链球菌的组织病料，通过细菌分离、生化鉴定、PCR诊断及药敏试验，鉴定为血清2型猪链球菌，为2型猪链球菌的诊断与治疗提供科学的参考依据。
1.1 材料
1.1.1 发病情况及病料采集
2021年5月18日广西宾阳县某规模化猪场外购963头体重15 kg左右的保育猪苗回来饲养，至5月31日起陆续出现猪只突然倒地、四肢划水及急性死亡的病情，每天死亡2~3头猪；
用药可以暂时控制病情，停药后又出现反弹。6月11日解剖并采集了2头病死猪的肺脏、脾脏、肾脏、脑组织及淋巴结等组织器官分别进行细菌分离鉴定。
1.1.2 主要试剂
普通营养肉汤，胰蛋白大豆琼脂（TSA）和胰蛋白大豆肉汤（TSB）均购自北京陆桥技术股份有限公司；
DNA提取试剂盒以及PCR相关试剂、DNA Ladder Marker等均购自天根生化科技（北京）有限公司；
微生物微量生化鉴定管和抗生素药敏纸片均购自于杭州天和微生物试剂有限公司；
革兰氏染液试剂盒为珠海贝索生物技术有限公司产品；
其他常规试剂均为分析纯；
相关引物由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 病原分离纯化
无菌操作采集的肺脏、脾脏、肾脏、脑和淋巴结等病料分别划线接种于TSA平板（含5%的新生牛血清），置于37℃培养箱中培养过夜，观察菌落生长形态特征，挑选形态一致的优势菌落进行革兰氏染色、镜检及挑单菌落进一步分离纯化。
1.2.2 生化试验
按生化试验的说明书进行操作，将分离纯化的菌株分别接种于甘露醇、甘露糖、棉籽糖、山露醇、阿拉伯糖、山梨醇、水杨素、β半乳糖苷、马尿酸盐、松三糖、乳糖、核糖、七叶苷、精氨酸双水解酶和精氨酸脱羟酶等细菌生化反应管，依据伯杰细菌鉴定手册对各生化反应结果进行判定。［7］
1.2.3 血清型的PCR鉴定检测
用分离纯化的细菌提取的基因组DNA做为模板，参照文献［8］根据猪链球菌不同血清型菌株荚膜多糖基因的特异性设计引物，分别用于猪链球菌血清1、2、7和9型的鉴定（表1）。PCR扩增反应为25 μL体系，分别为2×PCR pre-Mix 12.5 μL、ddH2O 9.0 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2.5 μL。PCR反应条件为95℃ 5 min；
94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s，35个循环；
72℃ 10 min；
最后4℃保存。PCR反应结束后，取10 μL PCR扩增产物于1%的琼脂糖凝胶进行电泳并观察记录结果。
表1 猪链球菌血清1、2、7、9型鉴定的引物
1.2.4 药物敏感性试验
选取红霉素、氟苯尼考、阿莫西林、多黏菌素B、恩诺沙星、环丙沙星、林可霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、卡那霉素等28种常用药物对分离纯化的细菌进行药敏试验，参照文献采用琼脂扩散法（K-B法）进行。
1.3 综合防治措施
根据猪场发病特征、实验室诊断的结果以及猪场用药时能够控制病情而停药后出现反弹的实际情况，建议猪场主要用猪链球菌灭活疫苗进行紧急免疫，同时再用敏感药物进行控制。
2.1 细菌分离纯化及形态特征
将组织病料接种的TSA平板置37℃温箱，经过夜培养后，发现其中一头病死猪的肺脏、淋巴结和脑组织接种的平板均有细菌生长；
而另外一头猪的肺、脾、肾和淋巴结也能培养出细菌，但脑组织没分离出细菌，送检病料样品各器官细菌分离结果如表2所示。在TSA平板上均可观察到形态一致，针尖大小、灰白透明、表面光滑的近圆形的菌落。
表2 送检病料样品各器官细菌分离结果
挑取单菌落涂片后进行革兰氏染色，镜检为G+菌，且以多个圆形或卵圆形组成的短链形式存在，符合猪链球菌的形态特征，具体镜检形态特征如图1所示。
图1 分离菌株革兰氏染色镜检形态特征
2.2 生化特性的鉴定
取分离纯化后菌株开展各种生化试验检测。分离菌株的生理生化特征如表3所示，结果显示，分离菌株糖、醇发酵能力以及各种生化试验的鉴定结果与猪链球菌的生化特性完全相符。
表3 分离菌株的生理生化特征
2.3 猪链球菌的分型鉴定
用猪链球菌的特异性分型引物来进行PCR扩增鉴定。PCR鉴定结果如图2所示，结果显示，猪链球菌血清1、7和9型的特异性引物均未扩出目的条带，而猪链球菌血清2型的引物扩增出450 bp的特异性目的条带，表明该分离株为猪链球菌血清 2型。
图2 猪链球菌血清1型、2型、7型、9型的PCR鉴定结果
2.4 药物敏感性试验结果
采用常用28种抗生素对分离菌株进行药物敏感性测定，结果详见表4。药敏试验结果显示，该链球菌对头孢哌酮、头孢克肟、头孢噻肟、米诺环素、万古霉素、壮观霉素6种药物高度敏感；
对头孢西丁、头孢拉定、头孢呋辛、红霉素、强力霉素、阿奇霉素、亚胺培南、氟苯尼考、阿莫西林、多黏菌素B、呋喃妥因11种药物中度敏感；
对链霉素、苯唑西林、氨曲南、左氟沙星、卡那霉素、恩诺沙星、环丙沙星、林可霉素、青霉素、氧氟沙星、泰乐菌素11种药物低度敏感或者耐药。
表4 分离菌株的药物敏感性结果 单位：mm
2.5 防控效果反馈
从5月31日猪场发生链球菌病例以来，至6月13日累计死亡28头猪。6月14日采取猪链球菌灭活疫苗的紧急免疫，同时用敏感药物进行控制，随后4天总共死亡3头，第5天之后就没有再出现链球菌病例，病情得到了完全控制。
猪链球菌是危害养猪业的重要病原菌之一，世界上几乎所有养猪国家都广泛存在该菌。猪链球菌血清型众多，以血清2型危害最为严重。1990年在我国广东省猪群中首次发现血清2型猪链球菌［9］，历史上我国出现过2次由2型猪链球菌感染引起人死亡的事件。其一是1998年江苏省猪场暴发的急性败血型猪链球菌血清2型疫情，造成14人死亡［10］；
其二是2005年夏天猪链球菌血清2型疫情在四川再次暴发，疫情殃及养猪从业者及生猪屠宰人员等，造成38人死亡，引起了世界范围内的高度关注。［11］除血清2型猪链球菌以外，血清1、7和9型等也是常见的引起猪感染发病的重要血清型，备受兽医工作者的重视。
猪链球菌病在临床上表现主要分为关节炎型、败血症型、脑膜炎型三种［12］。脑膜炎型通常表现为猪只突然倒地、站立不起、四肢划水、眼睑肿大和眼球突出的发病特征，及早发现及早救治的猪只一般能够康复，若发病超过2小时没有采取治疗措施，基本上以死亡告终。本试验从疑似猪链球菌感染的患病死亡猪体内分离到病原菌，经形态学和生化鉴定确定该菌株为链球菌，结合临床发病症状，初步判断为本次疫情为脑膜炎型链球菌病。由于链球菌荚膜多糖抗原性是确定其血清型的重要依据，基于荚膜多糖抗原基因的差异设计血清型特异引物可以对链球菌分离菌株进行精确的鉴定。王花茹［13］等建立的主要致病血清型多重PCR检测方法对猪链球菌血清1型、2型、1/2型、7型、9型、14型等6种主要致病血清型检出率可达100%。本试验中通过特异性的PCR引物对荚膜多糖基因进行检测，确定所分离的菌株为猪链球菌血清2型，为科学精准的制定防控措施提供了重要依据。
为能够提供可靠的治疗方法，本试验对分离菌株进行药敏测定。从药敏试验结果来看，分离菌株对链霉素等11种药物低度敏感或者耐药，对头孢西丁等11种药物中度敏感，对头孢哌酮等6种药物高度敏感。由于猪场投药能够较好的控制病情，但停药后病情反弹，结合临床治疗经验，建议其配合采取疫苗免疫的策略。据猪场主反馈，在紧急免疫猪链球菌灭活疫苗5天后，就没有再出现脑膜炎型链球菌的病例，收到了良好的防控效果。
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