朗道血清质控品作为ELISA法检测血清可溶性ST2室内质控物的可行性探讨
时间：2023-01-21 11:25:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
李全双，许 靖，吴 燕，王书安，杨艳君（徐州市中心医院/徐州市医学科学研究所，江苏徐州 221006）
可溶性生长刺激表达基因2蛋白（soluble growth stimulation expressed gene 2 protein, sST2）作为临床评价慢性心力衰竭患者预后的一种辅助手段，已在国内多家医院开展应用[1-4]。目前临床实验室测定sST2主要采用酶联免疫技术，由于其手工操作步骤较多，因此在进行检测时，室内质量控制 (internal quality control, IQC)尤为重要。然而目前的IQC工作尚存在不足，如该试剂盒是进口试剂盒，不配备质控品，进口的质控品（重组人ST2冻干粉），价格较昂贵；
且该进口质控品的有效期不足一年，与临床生化项目所用的冻干粉质控品如朗道血清质控品（有效期四年）相比较，有效期较短；
另外不同批号的进口质控品频繁更换使用，不便于IQC工作开展。目前国内尚未有sST2室内质量控制方面的文献报道。本实验室以方便IQC工作、简单易行、节省成本为原则，探索了朗道血清质控品作为sST2室内质控品的可行性。
1.1 研究对象 朗道人基质血清定值质控品（冻干粉）：中值Level 2，货号：HN1530，批号：1326 UN，规格：5ml；
高值Level3，货号：HE1532，批号：1006UE，规格：5ml，均由英国朗道实验诊断有限公司生产。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器：深圳汇松酶标仪MB580，MM-2微量震荡混合仪。
1.2.2 试剂：①sST2检测试剂盒：货号：BC-1065，批号：RN-61274, 规格：96T/盒，由Critical Diagnostics公司生产；
②sST2进口质控品：货号：BC-1066,批 号:RN-60733, 规 格：0.80ml，由Critical Diagnostics公司提供。
1.3 方法
1.3.1 朗道血清质控品处理：按照操作说明复溶朗道中值Level 2和高值Level 3质控品各一瓶，分别混合均匀，用无菌EP管各分装100管，每管50μl，标记后于-20℃保存。每次取出后室温解冻30 min，待完全溶解，轻轻混匀后与样本同步检测。
1.3.2 sST2检 测 方 法：sST2使 用 双 抗 体 夹 心ELISA法测定，每个测试样本用量为20μl。使用试剂盒提供的sST2标准浓度为400.0 ng/ml标准品，使用连续性倍比稀释法，稀释后sST2标准值浓度（ng/ml）分别是空白（0），S7（3.125），S6（6.25），S5（12.5），S4（25.0），S3（50.0），S2（100.0）和S1（200.0）。按照试剂盒实验步骤进行操作，用酶标仪在450nm波长测量各孔吸光度值(A)，将每个标准品的吸光度值与其对应的浓度值进行线性回归拟合，得到标准曲线及相关系数（r）。待测样本和质控品可从标准曲线中根据其吸光度值来查找对应的浓度值。
1.3.3 均匀性检验：参照中国合格评定国家认可委员发布的《CNAS-GL03能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[5],从分装的中值Level 2和高值Level 3质控品中随机各抽取10管用于均匀性检验，均按1～10编号，在重复条件下，检测两次。
1.3.4 稳定性评价：随机取中值Level 2和高值Level 3质控品各6管，每管重复检测2次，将所得均值作为初始均值。分别于第3，6，9，12个月随机各抽取6管，按上述方法进行检测，分别取其均值，结果以均值±标准差（±s）表示。
1.4 统计学分析 均值(x)和标准差(s)用Excel计算，成组t检验和单因素方差分析用SPSS19.0软件统计，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 sST2 ELISA法标准曲线的建立及确定检测的线性范围 在3.125～200.0 ng/ml标准区间，按照标准品sST2的测定结果建立的标准曲线，r值为0.99，在200 ng/ml时未出现钩状效应，故线性范围在3.125～200.0 ng/ml可以确认是可靠的。
2.2 朗道血清质控品中sST2 浓度的均匀性检验见表 1。通过对中值和高值质控品的两次结果分别进行单因素方差分析，F值分别是1.932，0.519，P值分别是0.181，0.481，差异均无统计学意义(均P＞0.05)，说明朗道质控品分装冷冻保存后均匀性很好。
表1 中值Level 2和高值Level 3分别检测两次的sST2结果（ng/ml）
2.3 朗道血清质控品中 sST2 含量的稳定性检验见表 2。中值Level 2和高值Level 3中sST2的初始均值分别是20.03±1.23 ng/ml，22.01±2.04 ng/ml。第3，6，9，12个月的均值分别与初始月均值进行t检验比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)，说明朗道血清质控品中sST2 含量的稳定性好。
表2 中值Level 2和高值Level3中初始月和其他月份均值结果（ng/ml）
可溶性生长刺激表达基因2蛋白（sST2）是白介素1受体（IL-1R）的家族成员之一。当sST2水平升高时，可与IL-33竞争性结合，使IL-33无法进入心脏保护的信号转导途径，导致心脏持续承压，从而出现细胞死亡和组织纤维化。因此定量检测sST2水平可以为临床辅助性评估慢性心力衰竭提供一个相对精确的工具[6-8]。目前主要使用ELISA法测定sST2，该技术虽已成熟，但在实际操作中仍会受到人工操作、实验环境等多因素的影响。该技术的IQC工作仍存在不足，质控品尚未国产化，室间质评（external quality assessment，EQA）工作也未统一开展。为了向临床提供可靠的检验结果，开展好sST2检测的室内质控工作，确保该检测系统的稳定性是临床检验的必然要求[9]110-111。
IQC是临床实验室质量保证体系的重要组成部分。质控品是做好IQC的重要工具。适宜的质控品应满足以下要求：稳定性好，有效期长，浓度符合检测项目需求，质控血清尽可能减少基质效应，反应速率尽量与人血清一致，且价格适宜[10]。本实验室临床生化常规项目使用的英国朗道公司生产的人基质定值血清冻干粉，其基质效应小，有高低值，在4℃左右保存有效期可达四年，且价格适宜，国内使用较为广泛。缺点是在使用之前必须溶解，复溶后的血清稳定时间短，必需分装冷冻保存。朗道人基质血清质控品提供的项目中未见有sST2项目，本研究对其中值Level 2和高值Level 3中sST2的浓度进行了探索。
本文参照中国合格评定国家认可委员发布的《CNAS-GL03能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》要求,对分装保存的朗道质控品进行sST2浓度的均匀性和稳定性评价，结果显示，在分装冷冻保存的中值Level 2和高值Level 3中，sST2浓度瓶间差异小，差异无统计学意义（均P＞0.05），说明分装冷冻保存的朗道质控品中sST2均匀性好；
经过一年的冷冻保存瓶间差异小，差异无统计学意义（均P＞0.05），说明稳定性至少在12个月，能够满足检测要求。临床关心检测项目的医学决定水平浓度的检验结果的质量，临床实验室更关心的是检测系统性能的质量。检测中只做1个水平的质控品，反应的质量是整个可报告范围的一个点，若能同时做2个或者更多水平的质控品，反应的质量是一个范围，质控的效果更好，因此在选择质控品时，应该有几个浓度且浓度分布较宽，最好接近该项目的医学决定水平[9]229-238，[10]。在朗道中值Level 2和高值Level 3中sST2的初始均值分别是20.03 ng/ml，22.01 ng/ml。本试剂盒sST2在3.125～200.0 ng/ml范围内，标准曲线中的r值为0.99，在200 ng/ml时未出现钩状效应，故线性范围在3.125～200.0 ng/ml可以确认是可靠的。本试剂盒推荐的正常参考范围小于35.0 ng/ml，因此中值Level 2，高值Level 3均可作为sST2低值质控品，可以监测标准曲线中sST2标准值S4(25 ng/ml)位点附近的检测质量。
下一步我们将利用检测剩余的患者血清样本自制sST2高值质控品，进一步探讨其应用的可行性，据此研究结果，逐步替代sST2的进口质控品。另外，我们将继续探讨sST2参考范围[11]，确定本实验室的参考值。本研究能够为开展sST2的临床实验室在IQC和EQA工作方面提供重要参考。
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