环丙氨嗪对鸡粪中亮斑扁角水虻生长的影响及添加活性炭对环丙氨嗪的解毒作用

张海旭, 裴亚欣, 张继冉, 索江华, 邓 新, 陈红歌, 林 晖, 杨 森

(河南农业大学生命学科学院, 郑州 450002)

近年来随着我国养殖业的快速发展，每年需要处理的畜禽粪便量也越来越多，据报道我国每年畜禽粪污产生量高达38亿t，但综合利用率却不足60%(吴浩玮等, 2020)。这些畜禽粪便中含有大量的营养物质尚未被充分利用，如若处理不善，不仅造成资源浪费，还会滋生病原菌并产生臭气和废水，对水体、大气和土壤造成污染。目前，我国畜禽粪便主要资源化利用方式是肥料化，其次是能源化和饲料化，但尚未形成典型的畜禽粪污资源化处理模式，且普遍存在处理设施运行成本高、处理效果差、处理周期长等一系列问题(宣梦等, 2018)。利用亮斑扁角水虻Hermetiaillucens(俗称“黑水虻”，以下简称“黑水虻”)，对畜禽粪便进行生物转化，不仅可以实现快速降解(Bradley and Sheppard, 1984)和减少臭气排放，还可抑制致病菌的繁殖，最终将其转化为黑水虻虫体和虫沙(van Huis, 2020; Wang SYetal., 2020; Wang Qetal., 2021)，虫沙可用作有机肥施于农作物(Gärttlingetal., 2020)，黑水虻虫体是迄今为止全球唯一获准用作水产养殖和家禽饲料成分的昆虫，总之，黑水虻被认为是全球大规模养殖最具潜力的昆虫物种之一(Zhanetal., 2020)。但在利用黑水虻处理鸡粪生产实践中经常会出现不明原因引起的幼虫大批死亡现象。通过调查研究发现，引起黑水虻大批死亡的主要原因是畜禽粪便中残留的兽药环丙氨嗪。

环丙氨嗪(cyromazine)又名灭蝇胺，是抑制双翅目昆虫幼虫生长发育的农药，在畜牧业中的主要应用是加入粪便中以抑制粪便中蝇蛆的繁殖。环丙氨嗪对动物的毒性极低，仅对目标物种具有潜在毒性(Donahueetal., 2017)，2019年世界卫生组织(WHO)将其评为轻度危害(Class Ⅲ)(WHO, 2020)。另外，根据WHO和世界粮农组织(FAO)的报道，母鸡摄入环丙氨嗪后，大部分(99%)随着排泄物排出，其中有75%是未经改变的原药，其余是其代谢产物三聚氰胺及微量的甲基环丙氨嗪和羟基环丙氨嗪(WHO, 2006)，进入粪便中的原药可以保持4～6周的药效(王辉等, 2008)。

此外，环丙氨嗪作为养殖业中一种常用防蝇蛆兽药，还具有操作方便、价格低廉和经济效益显著等特点，因此环丙氨嗪是控制养殖场所蝇蛆繁殖最具有成本效益的处理方法，特别是在鸡饲料中，甚至作为常年饲料添加剂被广泛使用(Mulla and Axelrod, 1983; Quisenberry and Foster, 1984; 王辉等, 2008; Donahueetal., 2017)。为了确保环境安全和人类健康，欧洲环境保护局(EPA)将动物饲料中环丙氨嗪的最大残留限量(MRLs)设定为5 mg/kg，为期6周，并至少在屠宰前72 h停止使用含环丙氨嗪的饲料，我国农业部(MOA)批准环丙氨嗪作为鸡饲料添加剂MRLs为5 mg/kg使用4～6周，但未设定强制停药期(Jietal., 2020)。在2007年和2008年我国环丙氨嗪原药销售量分别是119 t和103 t(杨大伟等, 2010)，Wei等(2016)在中国东部地区调查了施用动物粪便肥的土壤中13 种兽药残留，发现环丙氨嗪的检出率最高，并指出动物粪便，尤其是家禽养殖场的粪便，是土壤中兽药残留的主要污染源之一。Tomberlin等(2002)在商品家蝇饲料中测定了环丙氨嗪对黑水虻3龄幼虫的敏感性，但至今少见有关粪便中环丙氨嗪饲养黑水虻致死的报道和对不同龄期幼虫敏感性测定的研究。

活性炭是具有稳定化学性质和巨大比表面积及丰富官能团的一种无定型炭，可以通过物理和化学双重吸附作用非特异性地吸附多种物质，被广泛应用于金属离子吸附和水质净化等(Huetal., 1998; 范延臻和王宝贞, 2000)。此外当活性炭经口进入肠道后不会被分解和吸收，以原形随粪便排出体外(张宏顺等, 2005)。袁敏等(2012)发现活性炭对水溶液中的环丙氨嗪的最大吸附量为177 305 mg/kg；
Fernández-Pérez等(2011)指出活性炭可作为土壤中环丙氨嗪缓释吸附剂使用时。本研究测定了在鸡粪中加入活性炭后对黑水虻幼虫的影响，以及在鸡粪中添加活性炭对环丙氨嗪的解毒作用。

鉴于目前环丙氨嗪使用的广泛性和在粪便中的残留浓度远超黑水虻的致死中浓度，因此，为解决黑水虻无法处理含有环丙氨嗪鸡粪的问题，本研究目的是研究含环丙氨嗪的鸡粪对黑水虻幼虫生长发育(体重和死亡率)的影响，此外还探究了在鸡粪中添加活性炭对黑水虻幼虫生长发育的影响和对环丙氨嗪的解毒作用。

1.1 供试昆虫

黑水虻来自武汉品系，在不接触任何药剂的情况下使用餐厨垃圾，在室内(温度25～35℃，相对湿度35%～40%)条件下连续饲养至少20代以上作为供试昆虫；
根据体长和头宽来确定龄期(Barrosetal., 2019)，3龄幼虫是供试昆虫卵孵化后，在塑料盒(18 cm×32 cm×26 cm)内，保持温度27.7±1.8℃和相对湿度35%～40%，光周期16L∶8D下，用小麦麸皮饲养至3龄；
4和5龄幼虫是在盛有600头3龄幼虫上述塑料盒内加入1 kg的含水量75%的鸡粪，分别饲养2 d和6 d获得。

1.2 供试试剂和鸡粪

环丙氨嗪购置于阿拉丁公司(98%)；
活性炭(粉末)购置于天津市致远化学试剂有限公司(AR)；
鸡粪来自本实验室养殖的新杨黑蛋鸡，含水量75%左右，鸡饲料配方为玉米66%，豆粕22%，麦麸10%，石粉1%，1%预混料1%。

1.3 环丙氨嗪对黑水虻生长发育影响的测定

为了测定环丙氨嗪对黑水虻生长发育的影响，使用Cetin等(2009)方法并改进。首先，用蒸馏水制备1 mg/mL的环丙氨嗪储备溶液，然后用蒸馏水连续稀释储备溶液制备系列浓度使用液，取1 mL使用液加入盛有100 g鸡粪的500 mL组培瓶中并搅拌均匀，配制成含环丙氨嗪浓度为0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5和5 mg/kg的3龄和4龄幼虫实验组鸡粪，配制成环丙氨嗪浓度为0.5, 1, 2.5, 5, 10和15 mg/ kg的5龄幼虫处理组鸡粪，在对照组(不添加环丙氨嗪0 mg/kg)中加入1 mL蒸馏水。然后在每瓶中接入不同龄期幼虫60头，用纱布覆盖瓶口以防幼虫逃逸和外来物质干扰，每组3瓶重复。在温度为27.7±1.8℃、相对湿度为35%～40%、光周期为16L∶8D的条件下培养(Sripontanetal., 2019),每天记录每瓶死亡个体数，直至进入预蛹阶段。因幼虫体重的变化不仅能够反映其生长发育阶段，更是其转化有机固废物的重要指标之一(Liuetal., 2017)，对此每2 d从每瓶中随机挑选10头幼虫称量体重，直至进入预蛹阶段。

1.4 活性炭对黑水虻幼虫生长发育的影响和对环丙氨嗪的解毒作用测定

通过调查发现，1 mg/kg的环丙氨嗪浓度即可控制粪便中多数蝇蛆的发育，5 mg/kg足以控制各种蝇蛆的繁殖(邢云瑞, 等2017)，因此我们以1 mg/kg作为活性炭解毒能力的测试浓度；
此外，3龄幼虫是利用黑水虻进行生物转化有机垃圾的最佳龄期，从该龄期开始，幼虫开始进入暴食期(周芬, 2009)，因此我们选用3龄幼虫作为活性炭解毒作用测试的试验昆虫。

首先研究了在鸡粪中添加活性炭对黑水虻幼虫生长发育的影响。在盛有100 g鸡粪的500 mL组培瓶中加入1, 3, 5, 10和15 g活性炭，配制成活性炭添加量为10, 30, 50, 100和150 g/kg的处理组，以未添加活性炭组作为对照组(0 g/kg)，充分搅拌放置24 h后，每瓶接入60头3龄幼虫，每组3瓶重复。在温度为27.7±1.8℃、相对湿度为35%～40%、光周期为16L∶8D的条件下培养，每天记录每瓶幼虫死亡头数，每2 d从每瓶中随机挑选10头幼虫称量体重，直至进入预蛹阶段。

为研究添加活性炭对鸡粪中环丙氨嗪的解毒作用，首先在盛有100 g鸡粪的500 mL组培瓶中加入0.1 mg/mL 的环丙氨嗪使用液1 mL，配制成含环丙氨嗪浓度为1 mg/kg的鸡粪，再加入1, 3, 5和10 g活性炭，即配制成活性炭添加量为10, 30, 50和100 g/kg的实验组，以未添加活性炭组作为对照组(0 g/kg)，充分搅拌放置24 h后每瓶接入60头3龄幼虫，每组3瓶重复。在温度为27.7±1.8℃、相对湿度为35%～40%、光周期为16L∶8D的条件下培养，每天记录每瓶中死亡头数，每2 d从每瓶中随机挑选10头幼虫称量体重，直至进入预蛹阶段。

1.5 数据分析

死亡率=死亡头数/处理头数×100%；
采用IBM SPSS Statistics 26.0 PROBIT对1.3节中不同龄期幼虫的最终死亡数据和1.4节中在不同活性炭添加量中的幼虫的最终死亡数据进行回归分析，以确定环丙氨嗪对幼虫致死中浓度LC50和活性炭的95%有效剂量(95% effective dose, ED95)及其95%置信区间(Khan and Akram, 2017)；
方差分析采用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行ANOVA分析(F检验)，采用Waller-Duncan在P≤0.05显著性水平上标注；
采用GraphpadPrism9.0软件绘图并对最终死亡率进行独立样本t检验分析。

2.1 环丙氨嗪致黑水虻幼虫死亡表现

黑水虻3龄幼虫在含0.25 mg/kg环丙氨嗪的鸡粪中饲养、4龄幼虫在含2.5 mg/kg环丙氨嗪的鸡粪中饲养和5龄幼虫在5 mg/kg环丙氨嗪浓度的鸡粪中饲养后出现的死亡幼虫与其在不添加环丙氨嗪的鸡粪中饲养的正常幼虫如图1所示，可以看出与正常幼虫相比3, 4和5龄幼虫的死亡症状相似，均表现出体节伸长、不能正常移动、停止进食，直至死亡。

2.2 环丙氨嗪对黑水虻3龄幼虫生长发育的影响

黑水虻3龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中的死亡率变化见图2。从图2中可以看出当鸡粪中环丙氨嗪浓度为0.1 mg/kg时，不会导致3龄幼虫显著死亡，浓度等于或高于0.25 mg/kg将导致3龄幼虫死亡，且最终死亡率与对照差异极显著(P<0.001)，并且浓度越高3龄幼虫的死亡速度越快。

黑水虻3龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中的体重变化见表1。结果显示, 3龄幼虫食用含0.25 mg/kg及以上浓度环丙氨嗪的鸡粪3 d后，体重均显著低于对照组(P<0.05); 0.1 mg/kg浓度处理组的幼虫体重在鸡粪中饲养3和5 d时显著低于对照组(P<0.05)，而在饲养1和7 d至预蛹时，其体重与对照组无显著差异(P>0.05)。另外,0.25 mg/kg环丙氨嗪处理组虽有22.2%的幼虫生长至预蛹阶段，但其预蛹的体重显著低于对照组(P<0.05)。这些结果表明，鸡粪中0.1 mg/kg环丙氨嗪对黑水虻幼虫体重影响是短暂的，浓度达到0.25 mg/kg之后就会显著影响黑水虻幼虫的生长和预蛹的体重。

表1 亮斑扁角水虻3龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中饲养时的体重变化Table 1 Changes in the body weight of the 3rd instar larvae of Hermetia illucens rearedin the chicken manure containing different concentrations of cyromazine

2.3 环丙氨嗪对黑水虻4龄幼虫生长发育的影响

黑水虻4龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中的的死亡率变化见图3。从图3可知,当鸡粪中环丙氨嗪浓度不高于1 mg/kg时不会导致4龄幼虫显著死亡，在2.5 mg/kg及以上浓度将致使幼虫死亡，死亡率与对照差异极显著(P<0.0001)，且浓度越高4龄幼虫的死亡速度越快。

黑水虻4龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中的体重变化见表2。结果显示, 4龄幼虫食用环丙氨嗪含量在1 mg/kg及以上的鸡粪3 d后，幼虫体重均显著低于对照组(P<0.05)，而0.1 mg/kg和0.25 mg/kg环丙氨嗪处理组只在饲养5 d时与对照组相比显著降低(P<0.05)，其他时间与对照组均无显著差异(P>0.05)。另外, 1 mg/kg环丙氨嗪处理组虽有85.6%的幼虫生长至预蛹，但是其预蛹的体重显著低于对照组(P<0.05)。这些结果表明，鸡粪中0.1和0.25 mg/kg环丙氨嗪对黑水虻幼虫体重影响是短暂的，0.5 mg/kg环丙氨嗪不影响预蛹的体重，环丙氨嗪浓度高于1 mg/kg会显著影响黑水虻幼虫的生长和预蛹的体重。

表2 亮斑扁角水虻4龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中饲养时的体重变化Table 2 Changes in the body weight of the 4th instar larvae of Hermetia illucens rearedin the chicken manure containing different concentrations of cyromazine

2.4 环丙氨嗪对黑水虻5龄幼虫生长发育的影响

黑水虻5龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中的死亡率变化见图4，鸡粪中含10和15 mg/kg环丙氨嗪会导致幼虫死亡，且死亡率与对照差异极显著(P<0.0001); 5 mg/kg环丙氨嗪最终导致34.45%的幼虫死亡，与对照组无显著差异(P>0.05)。

黑水虻5龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中的体重随着时间变化见表3。

从表3中可以看出，5龄幼虫食用环丙氨嗪含量在5 mg/kg及以下浓度的处理组虽在饲养1-7 d时体重不同程度低于对照组，但在9 d预蛹时的体重与对照组和其他浓度处理组均无显著差异(P>0.05)，9 d时在10 mg/kg环丙氨嗪处理组中虽然有11.11%预蛹存活，但是其体重显著低于对照组和其他浓度处理组(P<0.05)。

表3 亮斑扁角水虻5龄幼虫在含不同浓度环丙氨嗪的鸡粪中饲养时的体重变化Table 3 Changes in the body weight of the 5th instar larvae of Hermetia illucens rearedin the chicken manure containing different concentrations of cyromazine

2.5 不同龄期黑水虻幼虫对环丙氨嗪的敏感性

鸡粪中环丙氨嗪对不同龄期黑水虻幼虫的毒力见表4，环丙氨嗪对黑水虻3, 4和5龄幼虫的LC50值分别为0.18, 1.39和6.45 mg/kg。结果表明，随着黑水虻幼虫龄期增长，其对鸡粪中环丙氨嗪的敏感性逐渐降低。

表4 鸡粪中环丙氨嗪对亮斑扁角水虻3, 4和5龄幼虫的毒力Table 4 Toxicity of cyromazine in the chicken manure to the 3rd, 4th and 5th instar larvae of Hermetia illucens

2.6 活性炭对黑水虻3龄幼虫生长发育的影响和对环丙氨嗪的解毒作用

首先在鸡粪中添加活性炭后饲养黑水虻3龄幼虫，结果添加量为10～150 g/kg的活性炭组并不会导致幼虫的死亡，其体重随时间变化如表5。从表5中我们可以发现，30, 50和100 g/kg活性炭处理组预蛹体重相比于对照组(不添加活性炭组，0 g/kg活性炭)和10 g/kg活性炭处理组显著提高(P<0.05)，而150 g/kg活性炭处理组相较于对照组在饲养9-13 d以及15 d时预蛹的体重显著降低(P<0.05)。结果表明，在鸡粪中添加量为30～100 g/kg的活性炭有助于3龄幼虫体重的增加，相对低的活性炭添加量(10 g/kg)对黑水虻幼虫的体重不影响，相对高的活性炭添加量(150 g/kg)影响了黑水虻幼虫的生长发育。因此在接下来的实验以活性炭添加量为10～100 g/kg展开。

表5 亮斑扁角水虻3龄幼虫在不同活性炭添加量的鸡粪中饲养时的体重变化Table 5 Changes in the body weight of the 3rd instar larvae of Hermetia illucens rearedin the chicken manure containing different levels of activated carbon

在含1 mg/kg环丙氨嗪的鸡粪中添加不同添加量活性炭后饲养黑水虻3龄幼虫，死亡率的变化见图5，从图5可知活性炭添加量为30, 50和100 g/kg的处理组相较于对照组死亡率(极)显著降低(P<0.0001)；
添加量为10 g/kg处理组相较于对照组死亡率无显著差异(P>0.05)，但死亡率达到100%的时间相较于对照组推迟1 d；
添加量为30 g/kg 处理组，在饲养4 d时出现死亡并在9 d时超过半数死亡，分别比对照组推迟了2 d和3 d，最终死亡率为70.6%，相较于对照组显著降低(P<0.01)。结果表明，在鸡粪中添加活性炭可以吸附鸡粪中的环丙氨嗪，活性添加量为50～100 g/kg可以完全解除环丙氨嗪对饲养黑水虻幼虫死亡的影响。

在含1 mg/kg环丙氨嗪的鸡粪中添加活性炭后饲养黑水虻3龄幼虫的体重的变化见表6。从6中可以看出活性炭添加量为50和100 g/kg时，能够解除环丙氨嗪对幼虫的体重的影响，添加量为30 g/kg时有29.4%的幼虫能够进入预蛹阶段，但其预蛹体重显著低于50 g/kg活性炭处理组和100 g/kg活性炭处理组(P<0.05)。

结果进一步说明了在含有1 mg/kg环丙氨嗪的鸡粪中，添加50～100 g/kg活性炭时可以完全解除环丙氨嗪对黑水虻3龄幼虫的影响，而添加量为30 g/kg的活性炭不能解除对幼虫生长发育的影响。

表6 亮斑扁角水虻3龄幼虫在不同活性炭添加量的含1 mg/kg环丙氨嗪的鸡粪中饲养时的体重变化Table 6 Changes in the body weight of the 3rd instar larvae of Hermetia illucens reared in the chickenmanure containing 1 mg/kg cyromazine with different levels of added activated carbon

活性炭对食用含1 mg/kg环丙氨嗪鸡粪的黑水虻3龄幼虫解毒作用见表7，活性炭的95%有效剂量(ED95)值为51.83 g/kg，说明含环丙氨嗪的鸡粪可以通过添加活性炭后再利用黑水虻进行处理。

利用腐食性昆虫处理有机垃圾，是目前国内外学者所推崇的一种生物转化方式，黑水虻作为熟知度最高、研究最广泛的昆虫，在畜禽粪便处理中具有重要的应用价值(Goldetal., 2018; Liuetal., 2019; Awasthietal., 2020; Surendraetal., 2020)。但是在利用黑水虻对畜禽粪便进行生物转化生产实践中，会出现黑水虻幼虫的大批量死亡现象，关于此现象的原因以及解决技术缺乏相关的报道。

环丙氨嗪致黑水虻幼虫的死亡症状与其对黑腹果蝇Drosophilamelanogaster(Wilson, 1997)和家蝇Muscadomestica幼虫的死亡症状(Awad and Mulla, 1984)类似，均表现出不能正常蜕皮发育。关于环丙氨嗪对双翅目幼虫的毒理Darriet等(2008)和Bloomcamp等(1987)认为环丙氨嗪对双翅目昆虫的作用方式是抑制甲壳素的合成，Friedel等(1988)认为环丙氨嗪是直接或间接作用于蜕皮酮的代谢，这一观点与本研究中环丙氨嗪对于黑水虻幼虫影响结果相一致，低浓度组的幼虫蜕皮被破坏，新的表皮在旧的表皮下出现，说明了环丙氨嗪并不抑制甲壳素的合成而是通过干扰蜕皮酮的代谢，导致幼虫不能正常蜕皮发育，进一步地影响黑水虻幼虫的正常代谢活动。

Tomberlin等(2002)报道了在商用家蝇饲料中黑水虻3龄幼虫对环丙氨嗪的LC50范围为0.13～0.19 mg/kg，较本研究在鸡粪中的LC50范围为0.17～0.19 mg/kg偏小，可能与饲养材料有关。此外本研究还测定了环丙氨嗪对黑水虻4龄和5龄幼虫的LC50值范围分别为1.29～1.50 mg/kg和6.10～6.81 mg/kg，表明了环丙氨嗪对3, 4龄和5龄黑水虻幼虫的LC50值不断升高，可能是由幼虫取食的累积效应引起的，Liu等(2017)研究表明，在3-4龄幼虫期是黑水虻采食量最大、生长发育速度和有机物积累最快的时期，5龄期幼虫摄食量下降，因此也不能摄入更多的环丙氨嗪，这一现象与环丙氨嗪对大劣按蚊Anophelesdirus、致倦库蚊Culexquinquefasciatus、埃及伊蚊Aedesaegypti和黑腹果蝇幼虫的影响(Phonchevinetal., 1985)相一致。

通过在含有环丙氨嗪的鸡粪中添加活性炭，发现活性炭对食用含1 mg/kg环丙氨嗪鸡粪的黑水虻3龄幼虫的95%有效剂量(ED95)为值为51.83 g/kg。此外本研究还发现在鸡粪中添加量为30～100 g/kg的活性炭能够对黑水虻体重增加起到促进的作用，而高添加量(150 g/kg)不利于黑水虻转化鸡粪，这与郭津研等(2021)在土壤中施用生物炭研究对甜菜夜蛾影响的结果相一致，即低添加量的生物炭处理幼虫存活率上升，而高添加量则出现不同程度的降低，这可能是在鸡粪中添加适当添加量的活性炭，不仅吸附了鸡粪中的环丙氨嗪等对黑水虻生长发育具有毒性作用的物质，还改变了鸡粪中的菌落结构(Zhangetal., 2021)，而较高添加量的活性炭可能减少了黑水虻幼虫对一些关键养分的吸收，比如氮、磷等(傅强等, 2018)。

鉴于目前环丙氨嗪在养殖业中使用的普遍性，且使用浓度(3 ～5 mg/kg)远高于黑水虻3龄幼虫的LC50值，对此建议在家蝇幼虫密集的区域使用高浓度(约1 000 mg/kg)的环丙氨嗪喷雾作为现场处理，同时应避免黑水虻幼虫饲养区域。若粪便中的环丙氨嗪浓度超过黑水虻3龄幼虫的LC50值，可通过添加活性炭处理后再利用黑水虻进行生物转化。

本研究虽然从鸡粪中环丙氨嗪对黑水虻幼虫的敏感性方面和活性炭解毒方面进行了阐述，但是由于本研究仅利用简单的生物学研究手段对敏感性和活性炭添加量进行了初步研究，内容尚不深入，对于环丙氨嗪对黑水虻造成的影响和吸附机制阐述尚不充分。后续将继续探究环丙氨嗪对黑水虻幼虫、蛹和成虫的影响，并对活性炭解毒作用机制做更深入的研究。

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