基于HPLC-FLD靶向分析古茶树游离氨基酸积累特征
时间：2023-01-15 18:00:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
方仕茂， 张 拓， 杨 婷， 田小强， 田洪军， 刘忠英， 潘 科
(1.贵州省农业科学院茶叶研究所，贵州 贵阳 550006；
2.沿河土家族自治县生态茶发展和技术指导中心，贵州 沿河 565300)
贵州省沿河县是中国古茶树之乡，存有丰富的乔木型和灌木型古茶树资源[1]。根据《贵州省古茶树保护条例》中的定义，沿河县树龄达100年以上的原生地天然生长和栽培型古茶树达万余株[2]。古茶树是研究茶树驯化起源以及特色茶树种质筛选的重要资源[3-5]。古茶树鲜叶试制红茶均呈现出醇和、鲜甜的滋味特征[6]，研究结果表明，古茶树红茶甜醇滋味特征与鲜叶中可溶性糖含量高度相关[7]。目前对贡献鲜甜味的游离氨基酸在不同类型古茶树鲜叶中的积累特点以及加工对其含量的影响尚不清楚。
茶叶中富含游离氨基酸类物质，目前在茶叶中鉴定出20种蛋白质游离氨基酸和6种非蛋白质游离氨基酸(如茶氨酸、γ-氨基丁酸等)，其中茶氨酸含量占茶叶中游离氨基酸总含量的60%，其次是谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和丝氨酸[8]。研究结果表明，茶氨酸、丝氨酸、甘氨酸和脯氨酸等游离氨基酸是贡献茶汤鲜爽滋味感官特征的主要化合物[9]；
另一方面，茶叶中游离氨基酸类物质参与茶叶香气的形成[10-11]。古茶树由于生长年限较长，其次生代谢与长期受到人工选择的茶树品种不同[12-13]。尽管当前大量研究从基因水平解析了茶树高积累儿茶素类、茶氨酸等特征代谢物的分子机制[14-16]，但对同一区域乔木型古茶树、灌木型古茶树以及选育品种茶树游离氨基酸代谢差异的研究尚未有报道。
为充分利用古茶树资源，解析古茶树产品甜醇滋味形成的物质基础，本研究利用高效液相色谱结合荧光检测器(High-performance liquid chromatography fluorescence detection, HPLC-FLD)分析不同树型古茶树鲜叶中18种游离氨基酸含量，结合化学计量学分析乔木型、灌木型古茶树与品质对照种茶树福鼎大白鲜叶中游离氨基酸的积累差异。另一方面，本研究分析红茶加工工艺对不同树型古茶树中游离氨基酸积累的影响。本研究对古茶树资源利用及古茶树红茶滋味品质形成具有重要意义。
1.1 样本收集与处理
16份茶鲜叶及16份干茶样于2020年3月采集自贵州省沿河县，具体采样信息参见文献[7]。样品包括乔木型鲜叶样品7份、灌木型鲜叶样品7份和品质对照种福鼎大白样品2份，每份包含3次生物学重复，每个重复取样50 g。鲜叶样品称质量后立即用锡箔纸包裹，置入液氮罐中浸没5 min，随后取出转移至干冰盒内暂存，最后保存于-80 ℃冰箱，待需要检测分析时采用真空冷冻干燥设备将样品进行冻干。古茶树红茶加工工艺依据《贵州红茶 工夫红茶加工技术规程(DB 52/T 639)》进行加工制取。冷冻干燥样品和干茶样品均通过恒温研磨机研磨，过40目筛后用于游离氨基酸的检测。
1.2 仪器与试剂
真空冷冻干燥机(ALPHR 1-4 LD plus，北京博励行仪器有限公司产品)，电子分析天平[ME204E/02，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品]，超纯水仪( KL-UP-III-20，成都唐氏康宁科技发展有限公司产品)，高效液相色谱仪配备荧光检测器(LC2030C Plus，日本Shimadzu公司产品)，乙腈和甲醇(美国Tedia公司产品)。
1.3 游离氨基酸的分离检测
1.3.1 样品制备和衍生 称取冷冻干燥的鲜叶样和干茶样1.500 g于锥形瓶中，加入220 ml沸水并在沸水中浸提45 min。浸提结束，将浸提液过滤并转移到250 ml容量瓶中，冷却至室温并用纯水定容，摇匀。用2.5 ml无针注射器抽取定容液，过聚醚砜(PES)膜(孔直径：0.22 μm)至1.5 ml离心管中，混匀。分别移取10 μl经PES膜过滤的溶液、70 μl AccQ·Fluor Buffer1和20 μl AccQ Fluor 2A(AccQ-Fluor Reagent Kit，美国Waters公司产品)于玻璃衬管中，随后将玻璃衬管置于涡旋器上涡旋混合15 s，涡旋混合液放置在55 ℃烘箱内加热10 min后取出，冷却至室温，用于进样分析。
1.3.2 HPLC-FLD定量分析游离氨基酸 基于HPLC-FLD对茶样中18种游离氨基酸化合物进行定量分析。色谱柱为AccQ·TagTM分析柱(60 Å，4 μm，3.9 mm×150.0 mm，1/pkg，美国Waters公司产品)。流动相A为稀释浓缩液(1∶10，体积比；
AccQ.Tag洗脱液∶水)，流动相B为纯乙腈，流动相C为超纯水，梯度洗脱程序为：0～17 min，100%～91% A，5% B，4% C；
24 min，80% A，17% B，3% C；
32 min，68% A，20% B，12% C；
34 min，68% A，20% B，12% C；
35 min，60% B，40% C; 38 min，100% A；
45 min，100% A。发射波长250 nm，检测波长395 nm。色谱柱流速为1 ml/min，柱箱温度25 ℃，进样量10 μl。
1.3.3 游离氨基酸分析 将17种游离氨基酸(天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)混合液标准品(美国Waters公司产品)和茶氨酸配制成不同梯度浓度样品，采用方法1.3.1中的方法进行衍生，制备标准品的分析样。通过绘制摩尔质量浓度(x轴)与同一保留时间的峰值面积(y轴)关系曲线，构建18个游离氨基酸标准品的标准曲线，获得曲线方程以及相关系数，用于计算样品中各氨基酸的含量。总游离氨基酸含量为上述18种游离氨基酸含量之和。
1.4 数据处理
数据统计及分析采用Excel、IBM SPSS Statistics，作图采用Origin 2017 64Bit。
2.1 不同树型古茶树鲜叶游离氨基酸积累差异
采用HPLC-FLD方法检测氨基酸具有高特异性、高灵敏度等优点。由图1可知，采用Waters-AccQ方法可以实现茶叶中18种游离氨基酸的良好分离，茶氨酸在不同树型古茶树鲜叶中含量均为最高(10号峰)，含量较低的氨基酸为半胱氨酸(11号峰)。定量分析结果(表1)显示，在乔木型、灌木型和福鼎大白品质对照中，鲜叶中茶氨酸的含量分别为(7.56±2.93) mg/g、(10.75±3.00) mg/g和(13.14±1.28) mg/g，分别占游离氨基酸总量的45.54%、57.64%和62.01%，组间含量均值差异显著(P<0.05)。其次，在18种游离氨基酸中丝氨酸、半胱氨酸、精氨酸和赖氨酸含量在3个类型茶鲜叶间无显著差异。
1～18分别表示天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。图1 游离氨基酸HPLC-FLD检测色谱Fig.1 Chromatogram of free amino acid detected by HPLC-FLD
茶鲜叶中游离氨基酸含量是决定干茶茶汤鲜爽味品质的关键。根据氨基酸单体化合物的感官呈味特性，可分为甜味氨基酸、苦味氨基酸和鲜味氨基酸[9]。表1显示，乔木型古茶树、灌木型古茶树及福鼎大白鲜叶中3种滋味属性的氨基酸含量存在差异。古茶树茶鲜叶中以鲜味氨基酸为主，苦味氨基酸和甜味氨基酸次之。在3种树型古茶树鲜叶中，乔木型古茶树鲜叶甜味氨基酸和鲜味氨基酸含量最低，苦味氨基酸含量最高，灌木型古茶树鲜叶中甜味氨基酸含量最高，苦味氨基酸含量最低，而福鼎大白鲜叶则含有丰富的鲜味氨基酸。茶鲜叶中鲜味、苦味和甜味氨基酸含量的占比差异，可为鲜叶的适制性提供参考，同时为工艺参数(如干燥温度、发酵时间)的选择提供理论依据。
表1 不同树型古茶树鲜叶游离氨基酸含量
2.2 不同树型古茶树干茶游离氨基酸含量差异
表2显示，干茶中游离氨基酸总量最高的是福鼎大白，其次为灌木型古茶树干茶，最低的为乔木型古茶树干茶。古茶树干茶中含量较多的氨基酸分别是茶氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸。根据滋味的呈味属性，乔木型干茶中甜味、鲜味、苦味氨基酸含量分别占总游离氨基酸含量的16.32%、58.03%、25.66%；
灌木型干茶中甜味、鲜味、苦味氨基酸含量分别占总游离氨基酸含量的16.61%、62.90%、20.07%；
福鼎大白干茶中甜味、鲜味、苦味氨基酸含量分别占总游离氨基酸含量、氨基酸含量的16.22%、64.79%、18.99%。干茶中甜味、鲜味、苦味3类氨基酸含量占比差异可能是影响茶汤品质的潜在原因，感官审评结果表明，古茶树茶汤滋味鲜甜醇厚特征突出，福鼎大白干茶则保留了更多的甜味氨基酸、鲜味氨基酸和较少的苦味氨基酸，体现出甜醇滋味特征。灌木型干茶中甜味氨基酸和鲜味氨基酸含量介于乔木型和福鼎大白干茶之间。
表2 不同树型古茶树干茶游离氨基酸含量
2.3 加工对古茶树红茶游离氨基酸含量的影响
茶叶加工影响风味物质的代谢进而形成其独特风味品质。图2显示了鲜叶-干茶中总游离氨基酸和茶氨酸含量的方差分析结果。在相同加工工艺条件下，总游离氨基酸含量在鲜叶样中存在一定组间差异，然而总游离氨基酸含量在干茶样品组间差异则不明显(P>0.05)。鲜叶中的丝氨酸、半胱氨酸、精氨酸和赖氨酸含量均值无显著差异(P>0.05)，干茶中丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和谷氨酸含量均值无显著差异(P>0.05)(表2)，表明通过红茶加工处理促进了乔木型和灌木型古茶树鲜叶中各氨基酸含量向无差异趋势变化，从而使风味品质呈现相似性。其次，根据氨基酸滋味属性分类结果，加工处理后甜味氨基酸和苦味氨基酸含量在3种类型古茶树干茶中无显著差异。表明加工可改变游离氨基酸含量，从而使得干茶滋味表现出一定稳定性。
图2 鲜叶和干茶中茶氨酸和总游离氨基酸含量Fig.2 Theanine and total free amino acid contents in fresh and dry tea leaves
干茶加工过程中茶鲜叶中游离氨基酸含量逐渐减少，但对不同滋味属性的氨基酸影响存在差异。由图2可知，乔木型和灌木型古茶树鲜叶经加工处理均使鲜味氨基酸(茶氨酸)含量减少，其中对灌木型古茶树中的茶氨酸含量具有显著影响。加工对甜味氨基酸和苦味氨基酸含量的影响则无规律。对比鲜叶与干茶不同滋味属性氨基酸含量差异可知，对于甜味氨基酸来说，加工未显著改变半胱氨酸、甘氨酸含量，但使得丝氨酸、脯氨酸含量极显著增加；
对苦味氨基酸来说，干茶样品中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸含量极显著增加，但对精氨酸含量的影响则不显著。
为明确乔木型、灌木型和福鼎大白在加工前后，即鲜叶和干茶中游离氨基酸含量的变化差异，以22个氨基酸的含量作为变量和鲜叶样品氨基酸含量、干茶样品氨基酸含量构建主成分分析(Principal component analysis, PCA)模型。图3A为3种类型鲜叶的主成分得分图，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的解释方差分别是39.852%和23.954%。16份样品(图中包括每一样品的3次技术重复数据)在该二维坐标中得到了较好的聚类，且存在明显的分离界限。图3B为前2个主成分的载荷得分结果，解释了图3A中乔木型、灌木型和福鼎大白鲜叶样品的聚类原因，即由于3类鲜叶样品贡献前2个主成分的氨基酸含量差异，进一步分析旋转后的分矩阵可知，PC1的解释方差主要是由缬氨酸、异亮氨酸、甜味氨基酸总量、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和酪氨酸贡献，PC2解释方差则由组氨酸、谷氨酸、苦味氨基酸总量、丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸和苏氨酸贡献。图3C显示，由于干茶样品经过加工后，样品内游离氨基酸变化趋于一致，导致样品在PC1和PC2的二维空间重叠，无明显的聚类分离轮廓。其次，灌木型和乔木型古茶树干茶样品相较于福鼎大白干茶样品体现出较为分散的特征。干茶样品主成分分析结果表明，通过图3D中前2个主成分载荷得分，难以实现样品的聚类(图3C)，即样品在22个变量中的整体差异不明显。
Asp：天冬氨酸；
Ser：丝氨酸；
Glu、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、The、Cys、Tyr、Val、Met、Lys、Ile、Leu、Phe、SweetAA、BitterAA、UmamiAA和TotalAA分别是谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、鲜味氨基酸和总游离氨基酸。图3 鲜叶样品氨基酸含量主成分得分(A)和载荷得分(B)、干茶样品主成分得分(C)和载荷得分(D)Fig.3 Principal component score plot (A) and loading score plot (B) for amino acid contents in fresh leaves, principal component score plot (C) and loadings score plot for amino acid contents in dry tea
古茶树生境和园艺措施是影响其茶鲜叶游离氨基酸积累的潜在因素。茶鲜叶中氨基酸、儿茶素等特征代谢物积累受到茶树施肥、采摘和修剪等园艺措施影响[17-18]，本研究发现乔木型古茶树主要以单株形式生长且经历园艺措施影响最小，主要受采摘影响，修剪和施肥等管理措施较少，而灌木型古茶树和福鼎大白茶树受到人工管理影响较为频繁，因此推测园艺措施影响是导致古茶树鲜叶游离氨基酸积累差异的主要原因。其次，不同古茶树类群生化成分含量的变异系数较大[19-21]，乔木型古茶树由于单株生长环境等差异，各单株茶鲜叶游离氨基酸含量存在较大的差异[22]。本研究的主成分分析结果亦表明，3种类型的茶鲜叶呈现较好的聚类分离特征，进一步说明生境和园艺措施差异影响了古茶树游离氨基酸的积累。
加工可以改善茶鲜叶品质差异从而塑造干茶相似品质。萎凋、揉捻和发酵过程中茶鲜叶受到水分、机械损伤等胁迫，促进蛋白质水解，有利于氨基酸含量增加。干燥过程，由于受到温度作用，游离氨基酸发生降解，其含量逐渐减少，使得茶汤鲜甜滋味减弱，影响茶汤品质。已有研究结果表明，茶氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸等氨基酸参与香气的形成且呈现烘烤味和花香[9]，与福鼎大白干茶相比，古茶树干茶表现出的木香感官特征是值得关注的，已有研究结果表明，存放陈化可能是形成红茶木香的潜在因素[23]，而是否有游离氨基酸参与形成木香尚不清楚。另一方面，古茶树干茶滋味整体呈甜醇味。已有研究结果表明，鲜叶经加工后多糖(蔗糖)水解为单糖(如葡萄糖、果糖)是贡献红茶茶汤甜味的潜在因素[7]。其次，灌木型古茶树鲜叶经过加工，总儿茶素含量减少，显著减少苦涩味物质的积累[8]。甜味氨基酸和鲜味氨基酸具有协同增强茶汤鲜甜、拮抗苦涩味的作用[24-25]，本研究对象福鼎大白干茶中鲜味氨基酸含量占比高于灌木型和乔木型古茶树干茶，结合感官审评结果可推测游离氨基酸亦是贡献茶汤甜醇滋味的重要物质。由于茶汤滋味是茶叶中浸出物质共同作用的结果，目前基本明确各主要物质的滋味属性[26-27]，但对于贡献茶汤甜醇滋味的关键化合物仍需要进一步的分子感官试验确定。
综上，采用HPLC-FLD方法能实现茶鲜叶和干茶中18种游离氨基酸的靶向检测。基于主成分分析等化学计量学方法可实现对样品的聚类，不同类型茶鲜叶游离氨基酸含量存在一定差异，通过加工工艺处理可弱化这一含量差异，从而塑造相似的干茶品质。本研究结果增进了对不同树型古茶树鲜叶游离氨基酸积累差异的认识，为不同树型古茶树红茶品质形成提供一定理论依据。
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