重复烟雾吸入建立肺损伤大鼠模型及肺纤维化评估
时间：2022-12-09 14:00:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
李虎明，纵加强，陈旭昕，丁毅伟，韩志海
解放军总医院第六医学中心 呼吸与危重症医学科，北京 100853
火灾时烟雾等吸入后可损伤呼吸道和肺实质，导致烟雾吸入性急性肺损伤(smoke inhalation induced acute lung injury，SI-ALI)，严 重 者 可 导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，病理表现为炎性细胞聚集、肺泡间隔增厚和肺水肿等[1]。建立可靠且贴近临床的SI-ALI动物模型是研究的基础，研究人员根据目的进行不同方法造模，如不同动物或不同吸入方式的模型，然而没有一种公认的模型可完全反映烟雾吸入损伤的特点[2]。而且烟雾吸入并发症的研究较少，其损伤后期是否发生肺纤维化仍存在争议。此外，火灾时消防员烟雾吸入致伤的比例高达30%[3]，消防员等人群重复烟雾吸入风险高，而重复烟雾吸入致伤特点未见相关研究。因此本研究采用烟雾吸入致伤模型，观察烟雾吸入损伤特点，比较重复烟雾吸入致伤与单次吸入致伤的特点，重点观察烟雾吸入损伤后期肺纤维化情况，为烟雾吸入损伤的机制研究奠定基础。
1实验动物 2 ~ 3月龄清洁级成年雄性SD大鼠120只，体质量180 ~ 220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]。实验前于清洁级动物房适应性饲养1周，室温20℃ ~ 24℃，环境湿度50% ~ 70%，昼夜12 h节律，自由摄食和饮水。动物实验操作遵守实验动物条例，所有实验过程经解放军总医院第六医学中心(原海军总医院)动物伦理学会审核通过(伦理审查批号：HJZYY20170901)。
2烟雾造模材料及设备 本研究采用现代建筑装修常见材料作为产烟物质，包括木屑、棉花、化纤材料、塑料、颗粒板材和电线，上述材料各10 g研磨成粉混合。应用自行研发的烟雾产生装置，产烟物质置于电磁炉上方的托盘中，控制电磁炉温度为300℃，待产烟箱中烟雾充盈后用排风机将烟雾通过管道排入试验箱中，同时用烟气检测仪检测箱内气体浓度，通过控制排风机维持气体浓度，CO 400 ~ 550 ppm，H2S 10 ~ 15 ppm，O218% ~ 20%。
3动 物 分 组 及 实 验 120只SD大 鼠 随 机 分 为4组，每组30只。A组为空白对照组，未经任何处理；
B组烟雾吸入1次(1次/d × 1 d，15 min/次)；
C组烟雾吸入3次(1次/d × 3 d，15 min/次)；
D组烟雾吸入7次(1次/d × 7 d，15 min/次)；
各组大鼠分别于完成烟雾吸入后第1天、第7天和第28天予以处理，进行炎性指标、血气分析、湿干比和肺组织病理检测。
4血气与炎性指标检测 大鼠于指定时间麻醉状态下腹主动脉取血，于30 min内进行动脉血气分析，并按ELISA试剂盒说明书操作，测定大鼠血浆中白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量。
5肺泡灌洗液检测 腹主动脉取血后，大鼠胸正中线开胸分离暴露气管、双肺，分离结扎右主支气管，气管内缓慢注入0.9%氯化钠注射液2 mL，回 抽 肺 泡 灌 洗 液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF) 1.5 ~ 1.8 mL。BALF于4℃下1 500 r/min离心10 min，取上清液采用ELISA方法检测IL-6、TNF-α含量。
6肺组织湿干比测定 分离右肺各叶，取右肺上叶组织，0.9%氯化钠注射液冲洗，用纱布吸干肺组织表面水分后称质量，记为湿质量，放于锡箔纸置于60℃恒温箱烘烤48 h至恒质量，再次称质量，记为干质量，计算肺组织湿干比。
7肺组织病理学观察 收集右肺下叶于4% 甲醛中，48 h后进行石蜡包埋，切片，脱蜡后行HE染色和Masson染色，光镜下进行组织学观察。
8统 计 学 处 理 使 用SPSS23.0软 件 分 析 数 据，计量资料以±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
1造模动物情况 A组精神状态佳，反应灵敏，被毛光洁，呼吸平稳，活动正常；
B、C、D组大鼠烟熏过程中呼吸急促，焦躁不安，口鼻分泌物增多，并可见发绀，烟熏后被毛泛黄无光泽，活动明显下降，2 ~ 3 d后逐渐恢复正常状态。其中，C、D组大鼠呼吸急促、焦躁不安等症状加重，烟熏后精神萎靡，活动缓慢，易捕捉。
2烟雾吸入死亡率 A组大鼠无死亡；
B组大鼠共死亡4只，总生存率86.7%；
C组大鼠共死亡7只，总生存率76.7%；
D组大鼠共死亡10只，总生存率66.7%。
3各组肺组织湿干比值比较 烟雾吸入后各吸入组肺组织湿干比在第1天最高，与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。随着吸入次数增多，湿干比逐渐升高(P＜0.05)。第7天、第28天湿干比逐渐降低。见图1。
图1 各组大鼠肺组织湿干比值比较(aP＜0.05, vs A组; bP＜0.05,vs 第1天时本组; cP＜0.05, vs 同时间B组)Fig.1 The wet-dry ratio of rats’ lung tissue in different groups(aP＜0.05, vs group A; bP＜0.05, vs the 1st day in each group;cP＜0.05, vs group B at the same time)
4各 组 血 浆 及BALF炎 性 指 标 比 较 B、C、D组IL-6和TNF-α在烟雾吸入后第1天明显升高，第7天、第28天逐渐下降，特别是BALF中IL-6在第28天时低于A组水平；
随着吸入次数增多，各炎性指标均有升高趋势。见图2。
图2 各组大鼠血浆及BALF炎性指标变化(aP＜0.05, B、C、D组 vs A组)Fig.2 Changes of inflammatory factors in each group after smoke inhalation (aP＜0.05, group B, C, D vs group A)
5各组血气分析指标比较 烟雾吸入第1天各吸入组大鼠动脉血氧分压(PaO2)、pH下降，动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、乳酸(lactic acid，Lac)和碳氧血红蛋白(carboxyhemoglobin，COHb)升高，第7天、第28天时各指标逐渐恢复至正常水平；
随着吸入次数增多，PaCO2和Lac有升高趋势，PaO2和pH有降低趋势，但大部分血气指标C、D两组与B组相比差异无统计学意义。见图3。
图3 各组大鼠动脉血气分析情况(aP＜0.05, B、C、D组 vs A组)Fig.3 Arterial blood gas analysis in each group after smoke inhalation (aP＜0.05, group B, C, D vs group A)
6各组大鼠肺组织HE染色 A组大鼠肺泡结构完整，腔内无渗出，肺泡间隔均匀一致，无肿胀。B、C、D组大鼠烟雾吸入第1天肺泡结构有弥漫性破坏，肺泡腔内可见红细胞和白细胞浸润，肺泡间隔增厚，炎细胞浸润明显。随着吸入次数增多，肺泡间隔增厚和炎细胞浸润更加明显；
第7天、第28天肺泡间隔较前好转，炎性细胞浸润减轻，肺泡腔内红细胞、白细胞减少。见图4。
图4 各组大鼠烟雾吸入后不同时间点肺组织HE染色(100×)Fig.4 HE staining images of the lung tissues of rats exposed smoke inhalation at different time points (100×)
7各组大鼠肺组织Masson染色 A组大鼠肺组织肺泡结构清晰完整，无蓝色胶原纤维沉积。B组第28天肺泡壁增厚，部分视野可见少量不均匀蓝色胶原纤维沉积，部分大鼠无纤维化改变；
C组、D组第28天出现较明显蓝色胶原纤维沉积，且范围更为广泛均匀，提示重复烟雾吸入后期可以导致明显肺纤维化改变。见图5。
图5 烟雾吸入后第28天各组大鼠肺组织Masson染色(100×)Fig.5 Masson staining images of lung tissues of different groups on the 28th day after exposure to smoke inhalation (100×)
烟雾吸入引起的肺损伤是火灾常见合并症[4]。吸入性肺损伤发病率差异较大，一项包括54项研究408 157名烧伤患者的Meta分析显示，吸入性损伤发生率1.2% ~ 74.6%，综合发生率为15.7%(95%CI：13.4% ~ 18.3%)，并且伴有吸入性损伤的患者死亡率显著升高(OR=3.2)[5]。另一项研究显示无吸入损伤的烧伤病人死亡率2%，而伴有SI-ALI的烧伤患者死亡率20%，继发肺部感染死亡率则高达60%[3]；
SI-ALI患者死亡率显著升高，而且缺乏针对性治疗措施，动物实验可行的救治措施临床效果均不理想[6-7]，因此建立SI-ALI动物模型，探索其发病机制及救治方法具有重要意义。建立动物模型是研究基础，现有多种烟雾吸入造模方法，为降低长时间烟雾暴露造成的动物死亡，缩短烟雾干预时间和间隔吸空气是常用策略[2,8]。Zhu等[9]的研究中大鼠烟雾暴露方案为3次3 ~ 5 min的烟雾暴露，中间于空气暴露30 s；
另一项研究烟雾吸入间隔时暴露于100%纯氧[10]。然而，没有一种动物模型是公认的可以完全反映烟雾吸入致伤改变的理想模型。因为动物烟雾吸入时间受限，损伤动物并发症出现较晚，烟雾吸入损伤远期研究较少，而在有限的研究中，损伤后期是否发生肺纤维化仍存在较大争议。此外，消防员、森林武警等特殊职业人群暴露于烟雾的风险高，存在重复烟雾吸入的风险，然而鲜有研究去了解重复烟雾吸入的致伤特点，重复烟雾吸入远期是否更易导致并发症亦未见报道。因此，本研究采用单次烟雾吸入、重复烟雾吸入建立多种烟雾吸入模型，观察烟雾吸入致伤情况，重点观察吸入后期肺纤维化情况，探索重复烟雾吸入致伤特点。
本研究结果显示，单次烟雾吸入后湿干比、炎性指标升高，血气指标改变，第1天最为严重，后随着时间的延长各指标逐渐趋向于正常。HE染色示损伤后肺组织弥漫性破坏和炎性细胞浸润，Masson染色显示损伤后第28天肺纤维化改变较少，部分大鼠未见纤维化改变。本研究中烟雾吸入建模能反映烟雾吸入的致伤特点，与烟雾吸入性损伤患者病理一致[11-12]。与此同时，本研究通过重复烟雾吸入来评估其损伤特点，结果显示重复烟雾吸入大鼠肺组织湿干比升高，血清及BALF炎性指标升高，肺组织损伤程度明显加重，而血气指标变化不大。需要特别关注的是，与单次烟雾吸入相比，重复吸入大鼠存在明显且均匀的肺纤维化改变。
肺组织湿干比可反映肺水肿程度，本研究中烟雾吸入致伤后第1天肺水肿最严重，湿干比最高，后逐渐降低，重复吸入组湿干比明显增高。炎症反应是烟雾吸入导致肺损伤的重要机制，其中IL-6和TNF-α是重要的炎性因子[13]。既往研究显示烧伤合并烟雾吸入患者IL-6含量增加[14]。本研究中IL-6和TNF-α在烟雾吸入后升高，重复烟雾吸入组升高更明显，另外随着时间延长，炎性指标逐渐下降。特别是第28天时，BALF中IL-6水平已低于对照组，其降低可能与损伤后期肺纤维化相关[15]。血气分析是反映气体交换的指标，其中氧合指数是诊断ARDS的必备条件[16]。本研究中烟雾吸入后PaO2、pH降低，PaCO2、Lac升高，后随着时间的延长各指标逐渐恢复正常，而重复吸入组与单次吸入组血气指标差异多无统计学意义，COHb在伤后第7天时已基本恢复正常，这与既往研究COHb 在损伤后2 h出现高峰，48 h大致恢复正常的结果一致[9]。
肺组织病理是判断损伤程度的重要指标，既往研究显示烟雾吸入后肺组织以炎性细胞聚集、肺泡间隔增厚和水肿出血为主要表现[1]。本研究中烟雾吸入后1 d时大鼠肺组织可见肺泡间隔增厚，并可见炎性细胞浸润，后随着时间的延长损伤程度减轻；
重复烟雾吸入组与单次吸入组相比，肺泡间隔、炎性细胞浸润加重。
烟雾吸入后是否发生肺纤维化仍存在较大争议。有研究显示烟雾吸入远期预后较好，无明显肺纤维化情况[1]。然而，Zhu等[9]的研究中吸入后第28天肺组织病理发生肺纤维化改变，可见肺泡壁增厚和纤维沉积，后续的研究也发现烟雾吸入后可发生肺纤维化改变[17]。本研究结果显示单次烟雾吸入第28天肺纤维化改变不明显；
重复烟雾吸入组大鼠肺组织纤维化程度明显加重，第28天时已出现广泛均匀的纤维沉积。分析其原因，可能是反复的烟雾吸入导致更为广泛且严重的肺组织破坏，后期修复异常，纤维组织沉积，从而导致肺纤维化改变[18]。
本研究发现重复烟雾吸入易导致肺纤维化改变，但本研究未进一步检测肺功能指标，不能明确肺的通气和换气功能情况。且本研究为动物实验，仍需通过临床进一步验证。在接下来的工作中，我们将开展临床研究，并进一步完善肺功能相关检查。
综上所述，我们建立了稳定的烟雾吸入性肺损伤大鼠模型，并通过改变烟雾吸入条件，建立了单次和重复烟雾吸入动物模型，并探索其损伤特点。结果显示，重复烟雾吸入可以导致更为明显的炎性反应，其肺组织渗透性和肺组织损伤程度均明显增加。尤其需要关注的是，单次烟雾吸入后第28天肺纤维化不明显，而重复烟雾吸入后第28天出现明显肺纤维化改变。
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