提高雌鼠受孕率方法的研究进展

刘 鑫 岑妍慧,2 李 森 何 爽 黄 慧

提高雌鼠受孕率方法的研究进展

刘 鑫1岑妍慧1,2李 森1何 爽1黄 慧1

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；
2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

实验鼠是科学实验中应用范围最广、应用数量最多的实验动物，也是生命科学研究中最重要的研究对象，生命科学的发展与进步离不开实验动物学的发展，为了提高实验研究的准确性、科学性以及统计学意义，科学实验中往往需要用到大量的实验动物模型，所以，如何有效地提高雌鼠的受孕率以扩大种群数量、推进实验进展、提高实验效率，成为了科学研究中的重要问题。文章通过查阅数据库中相关文献记载，对影响雌鼠受孕率的因素，以及有助于提高雌鼠受孕率的方法的研究进展进行综述。

雌鼠；
受孕率；
动情周期

生命科学的研究及发展和实验动物科学密不可分，而实验鼠是实验中应用范围最广、应用数量最多的动物。实验鼠在医学、药学、生物学、畜牧兽医学、农业学、化工学等科学领域的研究中都起到了非常重要的作用。由于实验鼠经济效益高、容易获得、易于饲养、成活率高、个体差异小、可操作性强、繁殖传代能力强、环境适应能力强、遗传背景明确、基因序列和人类相似度高，以及生理结构和病理转归与人类类似等优点[1-3]，实验鼠成为了科学研究领域中应用面最广、应用数量最多的实验动物。许多实验都需要以大量的实验鼠模型作为研究对象，或者实验过程中具有令实验鼠进行受孕或者传代的要求，所以雌鼠的受孕率成为了影响实验效率和实验进展的重要因素。所以实验鼠的饲养管理以及繁育技术越来越受到重视。本综述主要从雌鼠性周期动情期的把握、雌雄配比的选择、初次交配日龄及合笼天数、胎间隔和交配间隔、外界环境因素、社会心理学因素以及营养水平等方面对可以有效提高雌鼠受孕率的相关方法进行论述。

1.1 雌鼠性周期动情期的把握

在正常情况下, 雌鼠每隔4 d～5 d为一个性周期，发情后2 h～3 h即可排卵，在雌鼠排卵期间进行成功交配最有利于精卵结合完成受孕。因此鉴定并且把握实验鼠的动情期是提高雌鼠受孕率的关键。目前实际实验中常用到的确定雌鼠动情周期的检测方法有：宫颈粘液结晶法、阴道脱落细胞学检察法、角化细胞计数法[4,5]、外阴直接观察法等。值得一提的是，在以往研究[5]中发现，在宫颈粘液结晶法中，动情前期结晶为云雾状，动情期为典型的羊齿状，动情后期为金鱼草状，动情间期为椭圆体或者菱形物；
用阴道脱落细胞学检察法进行观察，若涂片上有大量角化上皮细胞和少量有核上皮细胞，细胞分散未成团成堆, 即可确认为动情期雌鼠[6,7]。在角化细胞计数法中，用低倍镜进行观察计数200个细胞，若无核角化细胞占据160个即80%以上，则可认定雌鼠处于动情期排卵后。宫颈粘液结晶法和阴道脱落细胞学检察法在检查过程中并没有完全客观的标准，可能会出现假阳性的情况，而角化细胞计数法与前两者相结合可以增加检测结果的准确度。但是因为这些检测方法操作相对复杂，耗费一定的时间和人力物力，所以在大多数的交配实验中应用并不广泛。相对而言，虽然外阴直接观察法在观察过程中存在主观性和不确定性，在一定程度上会影响观察结果的完全客观性和准确性，但是该类方法可操作性强，简便易行，直观经济，所以适合广泛应用于实验中。研究发现，在交配前检查雌鼠的阴道状态，若雌鼠的阴道口打开，外阴微肿，颜色呈粉红色，且阴道内有黏液分泌物，则为动情前期；
若阴道口开大，外阴肿胀，阴道口开大，呈灰白色，阴道干燥，则为动情期，此期进行交配成功率极高；
若外阴肿胀不明显或回复正常，阴道口紧闭，阴道内由粘液变为液状，则为动情后期；
若外阴无明显变化，略微湿润，阴道口紧闭，则为动情间期。实验过程中，可以通过及时在动情周期完成实验鼠交配或者人工诱导雌鼠进入动情周期并完成交配的办法，来提高雌鼠的受孕率。

1.2 雌雄配比的选择

在雌鼠与雄鼠进行合笼交配前，确定合适的雌雄配比，不但可以提高雌鼠的受孕率，还可以对鼠资源进行合理利用。在探讨不同雌雄配比下对大、小鼠的受孕率的实验中，当Wistar大鼠雌雄配比为1∶1、2∶1、3∶1时，其平均受孕率分别为19%、15.8%、9%；
当ICR小鼠雌雄配比为1∶1、2∶1、3∶2时，其受孕率分别为72.34%、60.71%、35.94%。两组研究均得出了雌雄配比为1∶1时，雌鼠受孕率最高的结论[8,9]。在生殖毒理实验中较常使用的雌雄配比一般为2∶1或者1∶1[10]。在美国的试验标准操作程序中规定，动物的雌雄配比为1∶1[11]，Wilson Jame Graves则认为雌雄配比可以是2∶1或者3∶2[12]。而也有研究显示，在实验小鼠的繁育实验中，在不影响小鼠的遗传质量控制的情况下，2∶1的雌雄配比是优于1∶1的[13]。由此可见，如果在短时间内孕鼠需求量大且实验鼠来源充足的情况下，采用受孕率最高的1∶1雌雄配比进行交配实验较为合适；
若在实验期限允许的条件下，选用2∶1的雌雄配比进行交配即可，这样既符合保证了生殖毒理实验的需要，又节省了实验经费和实验动物资源，更符合“3R”原则[14]，这也是目前实验室中较为普遍运用的实验鼠交配雌雄配比。

1.3 初次交配日龄及合笼天数

实验鼠的日龄、性成熟程度以及生理机能是影响雌鼠受孕率的重要因素。研究表明，实验鼠的初次交配日龄及合笼天数会在一定程度上影响雌鼠的受孕率。不同品系的实验鼠性成熟的日龄有所不同，所以其最佳初配日龄也略有差异。在不同初次交配日龄对小鼠繁殖性能的研究中发现，NIH小鼠在70～85日龄进行初次交配繁殖性能较好，雌鼠受孕率较高[15]；
昆明小鼠则是在75～90日龄进行交配繁殖性能较好，雌鼠受孕率较高[16]。不同品系的实验鼠的性成熟期和繁殖适龄存在差异，而且动物的性成熟期往往较动物的繁殖适龄要早[17]，即初次交配日龄若相对较小，会出现由于雌鼠与雄鼠虽然性成熟，但是实验鼠的其他生理机能尚未发育完全，导致雌鼠受孕率降低的情况。所以要根据实验鼠的品系和繁殖适龄确定其最佳初次交配日龄范围。且7～8月龄后繁育能力可能会下降，应及时常规替换8月龄实验鼠。

除此之外，延长合笼时间法也是实验中常应用的提高雌鼠受孕率的方法[18]。有实验研究表明，雌鼠合笼天数和受孕率成正相关，即合笼天数越多，雌鼠受孕率也越高[19,20]。从动物饲养的角度来考虑，有可能是因为雄鼠会影响雌鼠的孕周期，诱使其进入动情期，从而有助于提高了雌鼠受孕率。

1.4 胎间隔和交配间隔

雌鼠的胎间隔时间以及雄鼠的交配间隔时间是影响雌鼠受孕率的重要因素。在以昆明小鼠为实验对象的研究中发现，胎间隔时间大于102ｄ的雌鼠与交配间隔时间大于60ｄ的雄鼠进行交配，其受孕率相比于没有时间间隔的雌雄鼠显著下降；
胎间隔时间大于102ｄ的雌鼠或者交配间隔时间大于60ｄ的雄鼠，分别与无间隔的雄鼠、雌鼠进行交配后，其受孕率相比于没有时间间隔的雌雄鼠亦有显著下降。雌鼠胎间隔和雄鼠交配间隔越长，可能对实验鼠的影响越大[21]。因此，胎间隔时间过长的雌鼠或交配间隔时间过长的雄鼠的生育能力低下，直接或间接导致雌鼠受孕率下降。还有研究表明，昆明小鼠的胎间隔时间在繁殖6～7胎后增加[22]，此时应及时更换种鼠。所以在生殖毒理实验或者有雌鼠受孕要求的实验中，应尽量避免使用胎间隔时间过长的雌鼠或交配间隔时间过长的雄鼠。

2.1 垫料

实验鼠生存环境中的多种因素会对其生殖性能产生一定影响。实验室中用来饲养实验鼠的垫料种类繁多，欧美等发达国家的实验室动物多使用商品化的标准垫料，而我国实验室动物所使用的垫料则多是如刨花、锯末、玉米等木制品加工的下脚料。在探讨松木刨花，枫木刨花、纸皮和稻草4种垫料对NIH小鼠繁殖性能及仔鼠生长发育的影响的实验中发现，这4种垫料中松木刨花垫料对NIH小鼠的生长发育、繁殖性能指标有一定影响[23]。

2.2 物理因素

光照会对雌鼠的动情周期以及生长发育造成很大影响，从而影响雌鼠生理及生殖功能。不同的光照时间、光照波长以及色温都会对实验鼠的生理及生殖功能造成影响。有研究表明，光照可以促进雌鼠性激素的分泌，对雌鼠性周期产生一定影响[24,25]。实验鼠动情周期与光线波长有关，光照的照度、光线的波长以及明暗交替时间都对影响到雌鼠的生长生殖和发育。有实验表明，长光照通过刺激垂体—性腺轴的活动，引起内分泌活动的改变，从而使实验鼠的生长发育和生殖功能增强。实验室中通常通过人工调控光照，模拟自然日照，所以实验室里通常采用12 h∶12 h明暗光照，如果每天维持14 h的光照，可以较好地促进雌鼠的繁殖能力，从而提高受孕率。

环境温度会影响实验动物的繁殖能力，温度过高或者过低都会降低实验动物鼠的受胎率，而且高温会影响卵子受精以及受精卵的着床。除此之外，也有研究表明，在适宜条件下，雌鼠在夏季的受孕率高于其在春季的受孕率，所以选择夏季作为繁殖季节也可以有效地提高雌鼠的受孕率[18]。

噪音会在很大程度上干扰人和动物的生理以及心理状态，并且为此带来负面伤害。国家标准（GB l4925－2010）《实验动物环境及设施》规定，噪声不得超过60 dB，超出该范围将会对实验动物的生殖能力产生影响[25]。

有研究标明低湿度可以降低雌鼠的受孕率[26]。所以实验室里通常采用12 h∶12 h明暗光照；
恒温18℃～25℃，相对湿度40%～60%，噪音≤60分贝的相对稳定环境对实验鼠进行饲养和繁殖。

柯立芝效应又称为库利奇效应，是指雄性动物交配之后又立即与新配偶交配的现象[27]。大多数哺乳动物在交配之后的一段时间内，即使原有的配偶就在身边，也不再有性行为。这个阶段称为性不应期。其长短因动物的种类和周围环境而异，如果在雄性动物交配之后，重新给它安排一个新雌性发情对象，它的性不应期则会大大缩短，甚至立即又出现交配行为。柯立芝效应在雄鼠中普遍存在。雄鼠容易产生性疲劳[28], 从而不利于雌鼠成功受孕，所以当雌雄鼠合笼一段时间，雌鼠仍未受孕，应及时更换雌鼠配偶，以提高雌鼠的受孕率。

有实验研究发现，ICR小鼠在进行社会隔离饲养后，其动情前期和动情期延长，动情后期和动情间期几乎不发生改变，动情周期整体延长，从该实验结果中可以推断，社会隔离延长雌鼠的动情前期和动情期，相当于延长其排卵时间，从而可以提高受孕率，这或许是对隔离应激的一种适应性反应[29,30]。由此可见，对雌鼠进行低群体密度饲养，或许可以提高种群的受孕率。

实验鼠的生长、发育、繁殖以及健康的生理状态离不开营养物质的支持，营养物质的摄入水平可直接影响性激素的产生。营养水平低下会使雌鼠生殖功能降低；
营养水平过高会使雌鼠过肥，进而影响其发情，而公鼠过肥，其生殖机能也会受到一定程度的影响，进而雌鼠与雄鼠交配困难，同样也会影雌鼠的受孕率。因此维持正常且适宜水平的蛋白质、维生素以及矿物质摄入，对提高雌鼠的受孕率具有重要的意义。

为高效、稳定、大量地获取实验鼠种群数量，使用人为的药物手段对雌鼠进行超数排卵操作是科学实验和实验动物繁育中常用的技术手段。超数排卵，简称“超排”，顾名思义，这是一种利用外源性促性腺激素诱发卵巢的多个卵泡发育，从而获得更多胚胎的方法。目前科学实验中超数排卵常用到的促性腺激素通常是孕马血清促性腺激素（PMSG）与人绒毛膜促性腺激素（hCG）。有研究表明，孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）的使用剂量组合、注射孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）的时间间隔、给药雌鼠周龄以及超数排卵雌鼠所处发情周期阶段等都会对雌鼠超数排卵的结果产生影响[31,32]。并且，注射 10 IU 的孕马血清促性腺激素（PMSG）和 10 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG）的剂量组合获得受精卵最多，即雌鼠受孕率最高，效果最好；
注射孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）的时间间隔为48 h时促排卵效果最好；
不同品系的实验鼠，其最佳的促排卵周龄不同，周龄过小或者周龄过大均会导致卵母细胞变少、卵母细胞异常受精率增高，从而导致雌鼠受孕率下降。在国外的实验室，一般采用3～6周龄的雌鼠进行超数排卵；
处于不同动情周期的雌鼠也会产生不同的超数排卵的效果，而超数排卵效果最好的动情周期是雌鼠的动情初期和动情间期，发情初期和发情间期的卵母细胞获得数量和卵母细胞受精率明显高于动情期和动情后期。除此之外，雌鼠的体重也在一定程度上影响着超数排卵的效果，体重过轻或者过重都会对雌鼠的超数排卵产生不利影响，而体重和雌鼠的周龄、营养水平和饲养条件密切相关，通常在适宜的营养供给状态和饲养条件的基础下，雌鼠4周龄左右时的体重能达到最好的超数排卵效果[31-33]。

在各种实验动物种群中，实验鼠由于管理饲养方便、可操作性强、妊娠周期短、经济效益高等优点，在各类实验研究中被广泛使用。在进行实验鼠繁殖培育工作或者动物实验的过程中，雌鼠的受孕率直接或间接关系到实验进度、实验效率和实验结果。因此，在雌雄鼠交配繁殖实验中，要善于利用内在以及外在有利因素、规避不利因素。在实验过程中，可以通过诱导雌鼠进入动情周期或直接选择处于动情周期的雌鼠完成交配实验；
采用实验条件下最适用的雌雄配比；
选择适宜日龄的雌雄鼠进行交配繁殖；
适当延长合笼天数并且避免使用胎间隔时间过长的雌鼠和交配间隔时间过长的雄鼠；
饲养过程使用材质安全、对实验鼠繁殖性能影响较小的垫料；
保证实验鼠生活环境的温湿度、光照、噪音等条件温和且适宜；
饲养过程中保证适宜的营养供给；
及时更换雌鼠配偶、低种群密度饲养雌鼠等方法，达到提高雌鼠受孕率的目的，进而有效保证充足的实验鼠来源以及稳定的实验进度和效率。本综述通过总结和探讨提高雌鼠受孕率的方法，为归纳实验鼠的生长生殖性能的影响因素、探索实验鼠繁殖培育方式以及环境调控手段提供了新的理论依据，也为哺乳动物的饲养、繁育提供新了的思路和方法。

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Research Progress on Methods for Improving Pregnancy Rate in Female Rat

Laboratory rats are the experimental animals with the widest range and the largest number of applications in scientific experiments, as well as the most important research objects in life science research. The development and progress of the life sciences are inseparable from the development of laboratory zoology. In order to improve the accuracy, scientificity and statistical significance of experimental research, a large number of experimental animal models are often used in scientific experiments. Therefore, how to effectively improve the pregnancy rate of female rats to expand the population, promote experimental progress, and improve experimental efficiency has become an important issue in scientific research. This paper reviews the research progress of methods to improve the pregnancy rate of female mice by referring to relevant literature records in the database and combining with empirical rules in the laboratory.

female rat; pregnancy rate; estrous cycle

Q953

A

1008-1151(2022)12-0076-04

2022-09-06

广西自然科学基金面上项目（2020GXNSFAA259011，2019JJA140246）；
广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2021KY0291）；
广西一流学科建设开放课题（2019XK137）；
广西壮瑶药重点实验室子项目（GXZYKF2019-5，GXZYKF-201708）；
2020年大学生创新创业训练计划项目（202010600018）；
广西中医药大学校级科研项目（2019MS001）；
广西一流学科建设项目重点课题（2018XK023，2018XK024）。

刘鑫（1993－），女，河北石家庄人，广西中医药大学在读硕士研究生，研究方向为中草药防治相关疾病。

岑妍慧（1980－），女，广西北海人，广西中医药大学教授，研究方向为中草药防治相关疾病。

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