miR-216a通过下调CAPN6抑制宫颈癌细胞增殖并促进细胞凋亡的研究

张贤雨，马 欢，宋凤丽，张志林

(1.河北北方学院附属第一医院放疗科，河北 张家口 075000；
2.北京中医药大学第三附属医院放疗科，北京 100029)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，居女性癌症的第二位。近年来随着现代社会生活节奏的加快，宫颈癌患者趋于年轻化，其对女性生育及健康造成严重危害[1]。宫颈癌的病因涉及致癌基因激活、抑癌基因抑制等多种复杂的分子机制，而宫颈癌患者预后较差及生存期短均与宫颈癌发病机制密切相关。因此，寻找宫颈癌发生及进展的相关分子生物学标志物，明确有效的分子靶点，对宫颈癌患者的临床治疗效率具有重要应用价值[2-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是机体重要的非编码单链小RNA分子，作为基因表达的重要调控因子，其异常表达与肿瘤形成和进展密切相关，已成为肿瘤分子靶向治疗的研究热点[4-5]。研究显示，微小RNA-216a(microRNA-216a，miR-216a)在非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤中异常表达并参与肿瘤的发生发展，但其在宫颈癌中的作用及调控机制尚不清楚[6-8]。钙激活中性蛋白酶(calcium activated neutral protease，CAPN)是一组细胞内Ca2+依赖的半胱氨酸水解酶，可催化多种底物参与一系列细胞生物学过程[9]。钙激活中性蛋白酶6(CAPN6)是非典型的CAPNs，主要表达于哺乳动物胚胎肌肉、胎盘，在出生后表达下降[10]。研究发现，CAPN6在人子宫肉瘤、子宫肌瘤等生殖器官肿瘤组织中异常表达[11]，miR-216a可通过靶向抑制CAPN6表达而抑制子宫肌瘤细胞增殖、促进细胞凋亡[12]。本研究探讨了miR-216a对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响及与CAPN6相关的作用机制。

1.1临床资料

收集2019年5月至2021年5月于河北北方学院附属第一医院行手术治疗的82例宫颈癌患者的宫颈癌组织及癌旁正常组织。患者年龄为28～59岁，平均年龄(42.53±7.16)岁，均经病理检测确诊，术前未进行化疗、放疗等治疗。病理类型：宫颈腺癌19例(23.17%)，宫颈鳞状细胞癌63例(76.83%)；
国际妇产科联盟(FIGO)临床分期：Ⅰ期36例(43.90%)，Ⅱ期25例(30.49%)，Ⅲ期21例(25.61%)；
癌旁正常组织距宫颈癌组织>3cm，病理证实无肿瘤浸润、转移等病变。本研究经河北北方学院附属第一医院医学伦理委员会批准(K20190425082)，患者及家属均知情同意。

1.2材料和试剂

人宫颈癌HeLa细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)；
胎牛血清、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；
miR-216a模拟物(miR-216a mimic)及模拟对照序列(mimic-NC)、CAPN6小干扰RNA(si-CAPN6)及乱序无意义阴性序列(si-NC)(广州锐博生物科技公司)；
CAPN6过表达质粒(pcDNA-CAPN6)及空载质粒(pcDNA-NC)(美国Origene公司)；
Trizol试剂和LipofectamineTM2000试剂盒(美国Invitrogen公司)；
细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒；
人膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技公司)；
逆转录试剂盒和qRT-PCR(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；
兔抗切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(B cell CLL/lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、CAPN6、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(美国Santa Cruz公司)；
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的IgG二抗(美国Abcam公司)。

1.3实验方法

1.3.1 HeLa细胞培养

将人宫颈癌HeLa细胞接种于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素)，在37℃、5%CO2条件的细胞培养箱中传代培养，取生长良好的对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 HeLa细胞转染与分组

HeLa细胞按1×106个/mL的浓度接种于6孔培养板，培养24h后，严格按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书分别将miR-216a mimic、mimic-NC、si-CAPN6及si-NC转染至HeLa细胞，依次记为miR-216a mimic组、mimic-NC组、si-CAPN6组、si-RNA组；
共转染miR-216a mimic与pcDNA-NC、miR-216a mimic与pcDNA-CAPN6至HeLa细胞，记为miR-216a mimic+pcDNA-NC组、miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6组，同时设置未转染且正常培养的HeLa细胞为空白对照组(control组)。转染6h后更换培养基，转染48h后检测转染效率。

1.3.3实时荧光定量PCR法检测宫颈癌组织、癌旁正常组织及HeLa细胞中miR-216a和CAPN6 mRNA表达

采用Trizol法提取组织和HeLa细胞中总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA模板，采用qRT-RCR试剂盒进行实时荧光定量PCR(qRT-RCR)实验，检测宫颈癌组织、癌旁正常组织和HeLa细胞中miR-216a和CAPN6 mRNA的表达水平。

引物序列为：

miR-216a上游引物：5′-TGCGGTAATCTCAGCTTGGCA-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；
CAPN6上游引物：5′-ACTATGGGTCCTCCTCTG-3′，下游引物：5′-AGCTGGTGGTTGCTAATG-3′；
U6上游引物：5′-TGCG-GGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物：5′-CC-AGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；
GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

反应条件：95℃ 3min，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s，共进行40个循环。实验重复3次，miR-216a以U6为内参基因，CAPN6以GAPDH为内参基因，用2-△△Ct法计算miR-216a和CAPN6 mRNA的相对表达量。

1.3.4蛋白质印迹法分别检测宫颈癌组织、癌旁正常组织及HeLa细胞中CAPN6蛋白表达

收集宫颈癌组织、癌旁正常组织和处理后的HeLa细胞，加入放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液于冰上提取细胞中总蛋白质，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓冲液混匀，沸水浴中煮沸变性，取定量变性蛋白样品上样，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sufate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离，蛋白分离后转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，在5%脱脂奶粉中封闭1h，用含1mL/L吐温的Tris缓冲盐溶液(Tris-buffered saline-Tween，TBST)洗膜，加入CAPN6(1∶800)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入相应HRP标记的二抗(1∶2 000)，室温下孵育1h，TBST洗膜，增强化学发光试剂(enhanced chemiluminescence，ECL)显影，暗室成像拍照，以GAPDH为内参蛋白，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.3.5 CCK-8法检测HeLa细胞增殖活力

收集各组HeLa细胞，以2×103个/mL密度接种至96孔细胞培养板，每组设置5个复孔，分别常规培养24、48、72h后，每孔细胞加入10μL CCK-8试剂，继续培养2h，酶标仪测定波长450nm处的吸光度值(optical density，OD值)，以OD值表示细胞增殖活力。实验重复3次取平均值。

1.3.6流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡

将处理后的HeLa细胞以2×104个/mL接种于24孔培养板，常规培养24h，消化、固定细胞后，制备成单细胞悬液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用500μL预冷的结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，分别加入5μL AnnexinV-FITC染液和10μL PI染液，混匀，室温下避光反应15min，流式细胞术检测细胞凋亡率，实验重复3次取平均值。

1.3.7蛋白质印迹法检测凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和Bax及Bcl-2的表达

检测参照1.3.4中的方法；
其中Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗均按1∶1 000稀释。

1.4统计学方法

2.1 miR-216a和CAPN6在宫颈癌组织中的表达

在宫颈癌组织中，miR-216a mRNA相对表达量明显低于癌旁正常组织(t=52.968，P<0.05)，见图1A；
而CAPN6 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织(t=26.622，P<0.05)，见图1B；
宫颈癌组织中的CAPN6蛋白相对表达量明显高于癌旁正常组织(t=45.036，P<0.05)，见图1C、图1D。

注：※与癌旁正常组织比较P<0.05。图1 miR-216a和CAPN6在宫颈癌组织中的表达Fig.1 Expression of miR-216a and CAPN6 in cervical cancer tissue

2.2过表达miR-216a对HeLa细胞增殖活力的影响

control组、mimic-NC组、miR-216a mimic组的miR-216a mRNA相对表达量，以及HeLa细胞24、48、72h的增殖活力，经比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 过表达miR-216a对HeLa细胞增殖活力影响的比较Table 1 Comparison of effects of overexpression of miR-216a on proliferation activity of HeLa

两两比较：

mimic-NC组HeLa细胞中miR-216a mRNA相对表达量与control组比较无明显差异(t=0.411，P>0.05)，miR-216a mimic组HeLa细胞中miR-216a mRNA相对表达量均明显高于mimic-NC组和control组(t值分别为12.347和11.936，P<0.05)，表明miR-216a mimic成功转染至HeLa细胞。

mimic-NC组HeLa细胞24、48、72h增殖活力与control组比较均无明显差异(t值分别为0.662、0.765和0.235，P>0.05)，miR-216a mimic组HeLa细胞24、48、72h增殖活力均明显低于mimic-NC组和control组(mimic-NC组：t值分别为9.276、8.033和13.906，P<0.05；
control组：t值分别为9.938、8.798和13.670，P<0.05)。

2.3过表达miR-216a对HeLa细胞凋亡率及凋亡蛋白的影响

control组、mimic-NC组、miR-216a mimic组的HeLa细胞凋亡率，以及HeLa细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达量，经比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

两两比较：

mimic-NC组HeLa细胞凋亡率与control组比较无明显差异(t=1.001，P>0.05)；
miR-216a mimic组HeLa细胞凋亡率均明显高于mimic-NC组和control组(t值分别为22.825和23.827，P<0.05)，见表2、图2A。

mimic-NC组HeLa细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达量与control组比较均无明显差异(t值分别为1.279、0.738和0.738，P>0.05)；
miR-216a mimic组HeLa细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax相对表达量均明显高于mimic-NC组和control组(mimic-NC组：t值分别为21.746和19.940，P<0.05；
control组：t值分别为20.467和19.202，P<0.05)，Bcl-2相对表达量均明显低于mimic-NC组和control组(t值分别为22.895和23.633，P<0.05)，见表2、图2B。

表2 过表达miR-216a对HeLa细胞凋亡率及凋亡蛋白影响的比较Table 2 Comparison of effects of overexpression of miR-216a on apoptosis rate and apoptotic protein of HeLa

图2 过表达miR-216a对HeLa细胞凋亡率及凋亡蛋白的影响Fig.2 Effect of overexpression of miR-216a on apoptosis rate and apoptotic protein of HeLa cells

2.4过表达miR-216a对HeLa细胞中CAPN6表达的影响

control组、mimic-NC组、miR-216a mimic组的HeLa细胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量，经比较差异均有统计学意义(F值分别为58.990和156.820，P<0.05)。

两两比较：

mimic-NC组HeLa细胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量与control组比较均无明显差异(t值分别为0.565和0.594，P>0.05)，miR-216a mimic组HeLa细胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量均明显低于mimic-NC组和control组(mimic-NC组：t值分别为13.010和21.387，P<0.05；
control组：t值分别为13.576和21.981，P<0.05)，见图3。

注：*与mimic-NC组和control组比较P<0.05。图3 过表达miR-216a对HeLa细胞中CAPN6表达的影响Fig.3 Effect of overexpression of miR-216a on CAPN6 expression in HeLa cells

2.5下调CAPN6表达对HeLa细胞增殖的影响

control组、si-RNA组、si-CAPN6组的CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量，以及HeLa细胞24、48、72h的增殖活力，经比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

两两比较：

si-RNA组HeLa细胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量与control组比较均无明显差异(t值分别为0.288和0.594，P>0.05)，si-CAPN6组HeLa细胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量均明显低于si-RNA组和control组(si-RNA组：t值分别为16.454和19.604，P<0.05；
control组：t值分别为16.743和19.010，P<0.05)，表明si-CAPN6成功转染至HeLa细胞，见图4、表3。

图4 HeLa细胞中CAPN6蛋白表达水平Fig.4 Expression level of CAPN6 protein in HeLa cells

si-RNA组HeLa细胞24、48、72h增殖活力与control组比较均无明显差异(t值分别为1.414、0.397和0.235，P>0.05)；
si-CAPN6组HeLa细胞24、48、72h增殖活力均明显低于si-RNA组和control组(si-RNA组：t值分别为14.142、11.523和14.849，P<0.05；
control组：t值分别为12.727、11.126和14.613，P<0.05)，见表3。

表3 下调CAPN6表达对HeLa细胞增殖活力影响的比较Table 3 Comparison of effects of down-regulation ofCAPN6 expression on proliferation activity of HeLa

2.6下调CAPN6表达对HeLa细胞凋亡的影响

control组、si-RNA组、si-CAPN6组的HeLa细胞凋亡率，以及HeLa细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达量，经比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

两两比较：

si-RNA组HeLa细胞凋亡率与control组比较无明显差异(t=0.112，P>0.05)；
si-CAPN6组HeLa细胞凋亡率均明显高于si-RNA组和control组(t值分别为26.708和26.595，P<0.05)，见图5A、表4。

si-RNA组HeLa细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达量与control组比较均无明显差异(t值分别为0.639、0.738和0.594，P>0.05)；
si-CAPN6组HeLa细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax相对表达量均明显高于si-RNA组和control组(si-RNA组：t值分别为24.304和28.803，P<0.05；
control组：t值分别为24.944和29.542，P<0.05)，而Bcl-2相对表达量均明显低于si-RNA组和control组(t值分别为22.575和23.169，P<0.05)，见图5B、表4。

图5 下调CAPN6表达对HeLa细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of down-regulation of CAPN6 expression on HeLa cell apoptosis

表4 下调CAPN6表达对HeLa细胞凋亡率及凋亡蛋白影响的比较Table 4 Comparison of effects of down-regulation of CAPN6 expression on apoptosis rate and apoptotic protein of HeLa

2.7过表达CAPN6逆转了过表达miR-216a对HeLa细胞增殖的作用

miR-216a mimic组、miR-216a mimic+pcDNA-NC组、miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6组的CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量，以及HeLa细胞24、48、72h的增殖活力，经比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

两两比较：

miR-216a mimic+pcDNA-NC组HeLa细胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量与miR-216a mimic组比较均无明显差异(t值分别为0.411和1.294，P>0.05)，miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6组HeLa细胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量均明显高于miR-216a mimic+pcDNA-NC组和miR-216a mimic组(miR-216a mimic+pcDNA-NC组：t值分别为10.084和14.880，P<0.05；
miR-216a mimic组：t值分别为9.672和16.174，P<0.05)，表明pcDNA-CAPN6成功转染至HeLa细胞，见图6、表5。

图6 HeLa细胞中CAPN6蛋白表达水平Fig.6 Expression level of CAPN6 protein in HeLa cells

miR-216a mimic+pcDNA-NC组HeLa细胞24、48、72h增殖活力与miR-216a mimic组比较均无明显差异(t值分别为1.575、0.915和0.323，P>0.05)；
miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6组HeLa细胞24、48、72h增殖活力均明显高于miR-216a mimic+pcDNA-NC组和miR-216a mimic组(miR-216a mimic+pcDNA-NC组：t值分别为7.090、5.947和12.939，P<0.05；
miR-216a mimic组：t值分别为5.514、5.032和13.263，P<0.05)，见表5。

表5 过表达CAPN6逆转了过表达miR-216a对HeLa细胞增殖活力影响的比较Table 5 Comparison of effects of overexpression of CAPN6 on proliferation activity of HeLa cells by reversing overexpression of

2.8过表达CAPN6逆转了过表达miR-216a对HeLa细胞凋亡的作用

miR-216a mimic组、miR-216a mimic+pcDNA-NC组、miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6组的HeLa细胞凋亡率，以及HeLa细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达量，经比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表6。

两两比较：

miR-216a mimic+pcDNA-NC组HeLa细胞凋亡率与miR-216a mimic组比较无明显差异(t=0.944，P>0.05)；
miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6组HeLa细胞凋亡率均明显低于miR-216a mimic+pcDNA-NC组和miR-216a mimic组(t值分别为11.739和12.684，P<0.05)，见图7A、表6。

miR-216a mimic+pcDNA-NC组HeLa细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达量与miR-216a mimic组比较均无明显差异(t值分别为1.489、0.594和0.688，P>0.05)；
miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6组HeLa细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax相对表达量均明显低于miR-216a mimic+pcDNA-NC组和miR-216a mimic组(miR-216a mimic+pcDNA-NC组：t值分别为20.359和21.981，P<0.05；
miR-216a mimic组：t值分别为21.848和21.387，P<0.05)，而Bcl-2相对表达量均明显高于miR-216a mimic+pcDNA-NC组和miR-216a mimic组(t值分别为33.724和34.412，P<0.05)，见图7B、表6。

表6 过表达CAPN6逆转了过表达miR-216a对HeLa细胞凋亡率及凋亡蛋白影响的比较Table 6 Comparison of effects of overexpression of CAPN6 on apoptosis rate and apoptotic protein of HeLa cells by reversing overexpression of

图7 过表达CAPN6逆转了过表达miR-216a对HeLa细胞凋亡的影响Fig.7 Overexpression of CAPN6 reversed the effect of overexpression of miR-216a on HeLa cell apoptosis

3.1过表达miR-216a抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡

miRNAs是一类新兴的基因调节因子，参与了包括癌症在内的许多生理和病理过程。近年来，人们对miRNAs在癌症生物学中的重要作用进行了广泛的研究，发现miRNAs靶基因范围广泛，可通过负性基因调控维持细胞稳态。miRNAs作为肿瘤抑制因子和癌基因可参与各种癌症的发生进展。因此，调控miRNAs表达可作为宫颈癌、乳腺癌等多种癌症的治疗靶点[13-15]。miR-216a作为miRNA成员之一，被发现在多种肿瘤中异常表达。miR-216a在胰腺癌组织中表达下调，并通过靶向JAK2抑制胰腺癌的发生发展[16]。在口腔鳞状细胞癌组织和细胞系中miR-216a表达均下调，其通过靶向调节EIF4B抑制肿瘤的发生发展[17]。此外，miR-216a在肾细胞癌组织中表达下调，通过直接靶向TLR4发挥抑癌作用[18]。本研究检测了miR-216a在宫颈癌组织中的表达情况，结果显示，宫颈癌组织中miR-216a表达显著下调，而过表达miR-216a能够抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，并通过调控凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2表达促进细胞凋亡；
提示miR-216a可能作为抑癌基因参与宫颈癌的发生发展。

3.2下调CAPN6表达抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡

CAPN6位于X染色体，是非经典型CAPNs家族的成员之一，其在维持细胞稳定性、控制细胞运动和扩散，以及抑制骨骼肌分化、抗凋亡等方面发挥作用。Hong等[19]报道CAPN6是糖皮质激素的靶分子，通过细胞骨架重组和微管的乙酰化调节破骨细胞吸收。Rho等[20]报道CAPN6通过抑制细胞凋亡和促进血管生成促进肿瘤发生。说明CAPN6在调节肿瘤细胞凋亡和骨架动力学方面起到一定的作用。既往研究显示，子宫平滑肌瘤中过度表达的CAPN6与其他异常表达因子相互作用，通过相关的生化途径导致正常子宫肌层的病理变化[21-22]。最新研究发现，CAPN6的下调抑制子宫平滑肌瘤细胞增殖并促进细胞凋亡[23]。Lee等[24]发现CAPN6在子宫颈肿瘤的组织中过度表达，参与了子宫颈肿瘤的发生发展。本研究结果表明，CAPN6在宫颈癌组织中表达上调，而下调CAPN6表达可以抑制宫颈癌细胞增殖、促进细胞凋亡，同时下调CAPN6表达可增加Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达。该结果证实了CAPN6参与宫颈癌的发生，其有望成为治疗宫颈癌的潜在靶点。

3.3 miR-216a通过下调CAPN6表达抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡

CAPN6在肿瘤中作为一种潜在的致癌基因，受磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路调控，抑制癌细胞凋亡[25]。但CAPN6受miRNAs调控的机制尚不清楚。Liu等[26]研究发现，在肝癌细胞中CAPN6是miR-449a的新靶基因，miR-449a可通过下调CAPN6抑制细胞增殖，诱导细胞阻滞和细胞凋亡。本研究探索宫颈癌中miR-216a与CAPN6的关系发现，转染miR-216a mimic升高HeLa细胞中miR-216a表达水平后，HeLa细胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相对表达量明显降低，表明过表达miR-216a可显著下调宫颈癌细胞中CAPN6表达水平。miR-216a通过靶向调控多种基因参与肿瘤细胞生理学过程。miR-216a通过直接靶向磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移[27]。乳腺癌中miR-216a通过靶向PKCα促进癌细胞凋亡[28]。miR-216a还通过靶向调控PD-L1和MALAT1基因在肺癌、胰腺癌等肿瘤中发挥作用[29-30]。本研究将miR-216a mimic与pcDNA-CAPN6共转染至HeLa细胞，结果显示共转染后HeLa细胞增殖活力明显升高，细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2表达明显升高；
提示上调CAPN6表达可以逆转miR-216a对宫颈癌细胞增殖抑制、凋亡诱导的作用。本研究结果显示miR-216a可能通过靶向CAPN6调控宫颈癌细胞的增殖、凋亡。

综上所述，miR-216a在宫颈癌组织中表达下调，其在宫颈癌中可能发挥类似抑癌基因的作用，可抑制宫颈癌细胞增殖、促进细胞凋亡，其作用机制可能与下调CAPN6表达有关。miR-216a有望成为宫颈癌诊断和治疗的新靶点。

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