常乐康对早产小鼠CD8+T细胞CD28和PD-1表达的实验研究
时间：2023-02-12 21:35:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
刘萌萌，陶雪花，张士发，毛娟娟
(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 儿科,安徽 芜湖 241001)
人类免疫系统发育最早始于胎儿期。新生儿，尤其是早产儿，由于宫内受暴露抗原的限制，出生时适应性免疫系统“无经验”,存在免疫功能失衡[1]。出生后，具有丰富抗原的外部环境将可能诱导早产儿不适度的适应性免疫应答和/或耐受的发生，从而对健康成长带来不利影响[2-3]。适应性免疫的核心在于T细胞的增殖和分化，大约50%的CD8+T细胞会表达CD28，CD28是主要的共刺激分子，识别APC细胞表面的天然配体CD80和CD86，相互结合后激活T细胞的增殖和分化并分泌细胞因子。PD-1是一种抑制性信号分子，对效应T细胞、T细胞的分化、T细胞耐受、T细胞耗竭和外周炎症有重要作用，能有效调节机体免疫应答[4-6]。益生菌本质上是活的微生物，可能通过控制免疫反应的“开/关”，促进免疫系统发育和成熟[7]。目前有较多新生儿使用益生菌调节免疫系统的文献，主要关注于CD4+T细胞，而CD8+T细胞在适应性免疫中对机体免疫系统发育和成熟具有重要作用，目前相关研究较少。本研究通过对早产小鼠使用常乐康进行早期干预，观察小鼠CD8+T细胞表达CD28和PD-1的差异，以探讨常乐康对早产小鼠免疫系统发育的作用。
1.1 材料 常乐康(山东科兴生物制品有限公司)；
米福RU486(深圳市资福药业有限公司)；
FITC Hamster Anti-Mouse CD3、PE-CyTM5 Rat Anti-Mouse CD4、PE-CyTM7 Rat Anti-Mouse CD8、PE Hamster Rat Anti-Mouse CD28、PE Hamster Rat Anti-Mouse PD-1(美国BD Pharminge公司)；
PBS缓冲液(HyClone)。
1.2 方法
1.2.1 新生小鼠模型 SPF级BALB/c健康成年小鼠(6～8周，体质量18～22 g)，由江苏省南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。随机选择妊娠18 d的孕鼠腹腔注射RU486(剂量0.15 mg/kg)诱导早产，获得胎龄<20 d的早产小鼠(最小胎龄18 d)；
随机选择一部分孕鼠自然分娩，获得胎龄>20 d的足月小鼠(最大胎龄22 d)。本研究经过皖南医学院动物伦理委员会批准通过(LLSC-2020-070)。
1.2.2 分组及处理 将早产小鼠随机分为实验组(A组)和对照组(B组)，足月小鼠为足月对照组(C组)，每组各20只。A组使用常乐康灌胃(活菌散剂量为每袋500 mg，将两袋溶于1 mL生理盐水中，灌胃容积为每只100 uL)，剩余两组使用等量生理盐水灌胃，1周。
1.2.3 组织取材与标本制备 分别于第14、21天随机在3组中各取10只小鼠，经水合氯醛麻醉摘除眼球获取外周血，使用肝素抗凝管抗凝，静置备用。
1.2.4 CD28、PD-1检测 取两只流式管分别标记为a、b，各加入外周血100 μL，依次在a管中加入5 μL CD3e、CD4、CD8a、CD28，b管中加入5 μL CD3e、CD4、CD8a、PD-1，混匀；
将混合好抗体的外周血避光孵育30 min；
分别于各管中加入500 μL红细胞裂解液混匀后放置于37℃水浴箱，5 min；
离心5 min，离心力400 g，弃上清，再重复1次；
各管中加入2 mL PBS缓冲液进行清洗，离心5 min，离心转速1 500转/min，弃上清；
各管中加入700 μL PBS缓冲液后上机检测。
2.1 外周血CD8+T细胞表面CD28和PD-1的表达 通过FlowJo X软件分析小鼠外周血CD8+T细胞CD28和PD-1的表达。通过荧光信号或散射光信号的相对强度和相对细胞数进行圈门，从而分出T淋巴细胞，再根据表面荧光素的不同，区分CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞，最后在CD8+T细胞中圈出CD28+和PD-1，并记录其表达百分率。见图1。
2.2 CD8+T细胞表面CD28百分率及其平均荧光强度 第14天时，A组CD28百分率高于C组(P<0.05),但低于B组(P<0.05)；
第21天时，C组高于A、B组(P<0.05)。第14天时，A组CD28 MFI高于B、C组(P<0.05)；
第21天时，A组高于B组(P<0.05)，但低于C组(P<0.05)。见表1。
2.3 CD8+T细胞表面PD-1百分率及其平均荧光强度 第14天时，A组PD-1百分率高于B、C组(P<0.05)；
第21天时，B组高于A、C组(P<0.05)。第14天时，A组PD-1 MFI高于B、C组(P<0.05)；
第21天时，A、C组高于B组(P<0.05)。见表2。
益生菌是近年研究热门的一种微生物制剂，在临床上应用广泛。通过肠道消化吸收至全身进而诱导免疫调节、保护生理应激，对提高宿主的免疫功能有一定作用[8]。研究发现[9-10]，早产儿使用益生菌可稳定肠道微生物群，促进免疫系统的发育，提高适应性免疫。
T淋巴细胞一般会表达两套共信号受体：共刺激受体和共抑制受体。共刺激受体对幼稚T细胞的充分激活至关重要(如CD28)；
共抑制受体能降低T淋巴细胞的信号强度(如PD-1)[11]。CD28表达对于T细胞活化十分重要，也是T细胞初始启动的关键。CD28提供独特的信号，激发广泛的转录和代谢以及表观遗传的变化，进一步对T细胞的激活、扩增和分化产生影响。本研究发现，在第14天，A组CD28百分率处于两对照组之间，但CD28 MFI显著高于两对照组；
在第21天，A组CD28百分率和MFI均高于B组,但低于C组，提示常乐康能促进早产小鼠CD8+T细胞表达CD28，但在早期CD28的表达可能会暂时性地降低。CD28表达的缺失会导致CD8+T细胞失去细胞毒功能，同时抑制T细胞的增殖[12]。然而，由于肿瘤抗原的慢性刺激，癌症患者CD8+T细胞会失去CD28的表达，从而呈现对肿瘤抗原的无应答状态[13]。因此，CD8+T细胞表达CD28对免疫系统发育和成熟具有重要作用。本研究提示早期补充常乐康可能通过调控CD28的表达，对早产小鼠免疫系统的发育和成熟具有促进作用。
图1 CD8+T细胞表面CD28/PD-1表达图
表1 CD8+T细胞表面CD28百分率和MFI的比较
表2 CD8+T细胞表面PD-1百分率和MFI的比较
PD-1在T淋巴细胞激活后期被诱导，在T淋巴细胞活化时快速上调，激活后减弱TCR信号的传导和降低T淋巴细胞的活性，诱导凋亡，减轻机体过度免疫引起的免疫损伤[14-15]。本研究发现，在第14天，A组PD-1百分率和MFI均高于两对照组；
在第21天，A组PD-1百分率低于两对照组，但PD-1 MFI高于B组，稍低于C组，提示常乐康可下调早产小鼠CD8+T细胞表面PD-1 MFI，但在早期可能会暂时性增加PD-1的表达。研究发现[16]，高PD-1的表达是在癌症和慢性感染中因持续抗原刺激而产生的耗尽T细胞的标志，同时细胞因子的合成也受到限制，如PD-1在CD8+T细胞表面过表达是T淋巴细胞耗竭的一个重要提示。PD-1通过抑制TCR和CD28信号在效应性T细胞中发挥免疫抑制作用，也对Treg细胞产生负面影响[17]。因此，CD8+T细胞表达PD-1对免疫系统发育和成熟具有重要作用，本研究提示早期补充常乐康可能通过调控PD-1的表达，对早产小鼠免疫系统的发育和成熟具有促进作用。
此外，Hui等还提出了一些新的结论，PD-1可以特异性使CD28去磷酸化，即PD-1可以直接抑制CD28的信号阻断T细胞的激活[17]。同时也有研究证明，CD28被认为是有效的PD-1阻断治疗所必需的，CD28的缺失会削弱PD-1途径阻断的效果[18]。因此，CD28作为T细胞活化途径中的关键一步，在控制T细胞耗竭过程中作用明显。本研究发现，A组在第14天时，CD8+T细胞PD-1百分率明显高于CD28百分率，此时负性共刺激因子占主导地位，至第21天时，CD28百分率明显高于PD-1百分率，此时正性共刺激因子占主导地位。相较于B组而言，A组正向共刺激因子恢复优势地位的速度更快，CD28的表达量也更高。提示早期补充常乐康可更早的恢复正向共刺激因子的主导地位，抑制负性共刺激因子，减少T细胞耗竭，有效促进早产小鼠免疫功能的成熟。
综上所述，使用常乐康进行干预可能刺激早产小鼠外周血中CD8+T细胞的活化、增殖等，其生物学功能可能是通过平衡CD28和PD-1的表达，进而发挥适应性免疫功能，从而促进早产小鼠免疫系统的发育和成熟。同时，本实验也存在不足之处，使用常乐康处理实验组的时间仅为7天，实验组的表达水平仍不及足月组，在今后的实验可以适当延长实验组的处理时间，以获得常乐康的最佳疗效。为在临床上积极、合理的使用益生菌制剂提供理论基础，以减少早产儿并发症的发生并改善预后。
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