氧化胭脂虫红酸用于蘑菇中的铁离子检测

刘兰香，李 想,2，唐保山，谭 瑞,2，徐 涓，马金菊，张 弘,*

（1.中国林业科学研究院高原林业研究所，国家林业和草原局特色森林资源工程技术研究中心，国家林业和草原局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 650233；
2.西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224）

铁是各种生物所必需的微量元素之一，几乎每一个生化过程中都需要，包括细胞呼吸、细胞增殖、携带氧分子的生物合成、核酸的合成和修复以及作为许多其他酶反应的辅助因子[1-3]。研究发现，缺乏铁会导致多种症状贫血[2-4]，同时会引起哺乳动物的神经发育迟缓和认知缺陷[5]，也可能引起局部的病理损伤等[6]。通过食物摄入是补充每日所需微量元素铁的最简单而有效的方式，例如，人们颇为喜爱的食物蘑菇中就富含铁元素。然而，铁同时具有神经毒性作用，铁累积会产生活性氧从而导致细胞周期停滞，最终导致细胞死亡[6]。因此，对食物进行微量铁元素检测，对于每日合理膳食具有重要的指导意义。目前，电感耦合离子质谱法[7]、电化学分析法[8]、火焰原子吸收法[9-10]等多种检测方法可以实现食物中微量铁元素的检测[11]，这些方法具有灵敏度高、检测限低、准确度好等优点，但是存在仪器设备昂贵、测试成本高的问题。近年来，基于荧光传感器的分析方法因其具有较高的选择性和稳定性，且操作简单、分析迅速而受到广泛的关注。

胭脂虫红酸是天然染料胭脂虫红色素的主要成分，其结构中包含1 个α-糖苷基团和1 个多羟基蒽醌结构（图1），被广泛用于食品、药品以及高端化妆品等领域[12-14]。胭脂虫红酸中在水、甲醇、丙酮等溶剂中可发射波长约为600 nm的红色荧光，在金属离子检测、生物蛋白识别、农残检测等方面具有较大的应用潜力[15-19]。然而，以胭脂虫红酸为荧光传感器用于分析检测，存在荧光强度低和灵敏度有待提高等问题，从而限制其实际应用。据报道，芳香族化合物中加入合适的氧化剂在高温高压的条件下会发生脱氢氧化以及脱水缩合反应，得到具有更大共轭程度的π-π结构且荧光性能更优异的物质，从而提高其作为荧光传感器的灵敏度而应用于荧光分析检测[20-22]。

本研究以胭脂虫红酸为原料，高碘酸钾为氧化剂，通过乙醇/水共混热溶剂法制备氧化胭脂虫红酸（oxidized carminic acid，OCA），然后对其进行结构表征和应用，期望将荧光性能优异的OCA开发为荧光传感器用于蘑菇中金属离子的检测，进一步拓展天然色素胭脂虫红酸在荧光分析检测方面的应用。

图1 胭脂虫红酸的结构式Fig. 1 Structural formula of carminic acid

1.1 材料与试剂

新鲜香菇、白菇和杏鲍菇购买于本地超市。

胭脂虫红酸（纯度≥95%）由中国林业科学研究院高原林业研究所提取和纯化；
高碘酸钾 美国Adamas公司；
罗丹明B、氯化钠、亚硝酸钠、氯化铁等无机盐（均为分析纯） 天津风船化学试剂科技有限公司；
乙醇（分析纯） 广东光华科技股份有限公司；
实验室用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

AB204-S型精密型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；
C-MAGHS-7型磁力搅拌器 德国IKA公司；
KOFD1-10/3高压反应釜 烟台招远松岭仪器设备有限公司；
F-4600荧光光谱仪 日本Hitachi公司；
UV-4802S紫外-可见分光光度计（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）尤尼柯上海仪器有限公司；
TENSON27型傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometry，FT-IR）仪 德国布鲁克光谱仪器有限公司；
ST20PH测试笔 奥豪斯仪器有限公司；
Nano ZS90动态光散射仪（dynamic light scattering，DLS） 英国Malvern仪器有限公司；
Scientific K-Alpha X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）仪、电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）仪 美国Thermo公司；
Tecnai G2 F20透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 OCA制备

准确称取5.0 mg胭脂虫红酸于烧杯中，加入6 mL去离子水使其充分溶解后将溶液转移至高压反应釜中，并用15.0 mL乙醇洗涤烧杯并转移至高压反应釜，然后加入30.0 mg高碘酸钾，将混合溶液密闭后在180 ℃条件下于马弗炉中反应1 h。待反应混合溶液自然冷却至室温经0.45 μm有机系滤膜过滤，所得滤液即为OCA。

1.3.2 荧光量子产率测定

以荧光量子产率为89%的罗丹明B作为标准参照物，通过测定OCA溶液和罗丹明B溶液在波长336 nm下的荧光发射峰的面积和对该波长光的吸光度，按式（1）计算荧光量子产率[20]：

式中：Ф、S、A分别为OCA的荧光量子产率、荧光发射峰面积及吸光度；
ФR、SR和AR分别指参比物罗丹明B的荧光量子产率、荧光发射峰面积及吸光度；
η为乙醇/水混合溶剂的折射率1.362 1；
ηR为溶剂水的折射率1.332 5。

1.3.3 结构表征

1.3.3.1 FT-IR测定

将15 mL OCA溶液经80 ℃减压蒸馏2 h，得到干燥的OCA固体粉末。然后，采用溴化钾压片法分别将干燥的OCA和原料胭脂虫红酸与溴化钾混合压片进行测试，扫描波数范围4 000～400 cm-1。

1.3.3.2 XPS测定

OCA测试用的靶材为Al，Kα，X射线束能为100 W，测试光栅直径为100 mm，光斑为400 μm。数据分析时，以C1s吸附碳C—C/C—H结合能284.8 eV对所有谱峰进行校准，使用Avantage软件对XPS数据进行分峰拟合。

1.3.3.3 TEM测定

样品测试点分辨率为0.24 nm，信息分辨率为0.14 nm，最高加速电压为200 kV。

1.3.4 环境pH值对OCA荧光性能的影响

分别配制pH 3、5、9、11和13的盐酸和氢氧化钠溶液，考察不同pH值溶液对OCA荧光性能的影响。测试时，取1.0 mL不同pH值的溶液与3.0 mL OCA溶液混合15 min，然后超声15 min后在激发波长为336 nm，光电倍增管电压（photomultiplier tube，PMT）为700 V的条件下检测溶液的荧光性能。

1.3.5 离子对OCA荧光性能的影响

准确配制浓度均为1.0 mmol/L的氯化钠、亚硝酸钠、硝酸钠、醋酸钠、亚硫酸钠、硫酸钠、硫代硫酸钠、碳酸钠、草酸钠、磷酸二氢钠溶液共10种阴离子不同的溶液；
氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化亚铜、氯化铜、氯化钡、二氯化汞、氯化锌、氯化镁、氯化钙、氯化镍、氯化锰、氯化铅、氯化亚铁、氯化铁、氯化铝和氯化铬17种常见的金属氯盐溶液。然后，分别准确量取1.0 mL盐溶液与3.0 mL OCA溶液混合并超声15 min；
同时设置添加1.0 mL的去离子水的样品为空白样，将所得样品在PMT为700 V，激发波长为336 nm条件下进行荧光检测，考察不同阴离子和阳离子对OCA荧光性能的影响。

1.3.6 抗干扰性实验

将4.0 mL OCA溶液和1.0 mL浓度为1.0 mmol/L的氯化铁溶液混合，然后分别加入1.0 mL浓度为1.0 mmol/L的其他金属离子溶液，混合15 min后再超声15 min，然后在PMT为700 V、激发波长为336 nm条件下测定溶液的最大荧光强度，同时设置空白对照。

1.3.7 OCA检测Fe3+的工作曲线

准确配制质量浓度为56.0 mg/L的FeCl3储备液，然后逐级稀释至质量浓度分别为11.2、22.4、33.6 mg/L和44.8 mg/L。测试时，分别准确量取1.0 mL不同浓度的Fe3+溶液与3.0 mL OCA溶液混合均匀15 min后再超声15 min，然后将混合液在激发波长为336 nm，PMT为700 V条件下进行荧光检测。记录被检测样品位于发射波长380～620 nm区间的荧光发射峰积分面积为S，空白样品为S0。最后，以Fe3+的质量浓度为横坐标，（S0-S）/S0为纵坐标绘制标准工作曲线。

1.3.8 OCA检测Fe3+的应用

将新鲜的香菇、白菇和杏鲍菇分别置于组织研磨机进行粉碎后在105 ℃条件下干燥1 h，然后分别准确称取50.0 mg样品置于消化管中，加入2.0 mL硝酸放置1 h，然后进行热消解。待样品消解完全后将酸除尽，冷却后加入10.0 mL水，过滤，滤液转移至50 mL容量瓶然后用去离子水定容，得香菇（A）、白菇（B1）和杏鲍菇（C1）溶液，将香菇溶液稀释5、3 倍和2 倍，即得香菇供试品溶液A1、A2和A3；
白菇和杏鲍菇溶液分别稀释2 倍和3 倍，即得白菇供试品溶液B2、B3和杏鲍菇供试品溶液C2、C3。荧光方法检测时，将1.0 mL供试品溶液与3.0 mL OCA荧光传感器溶液混合，按照1.3.7节的方法进行荧光检测。同时，所有供试品溶液进行ICP-MS检测，以验证荧光方法的准确性。

2.1 OCA的表征

2.1.1 FT-IR分析

图2 胭脂虫红酸和OCA的FT-IR光谱Fig. 2 FT-IR spectra of CA and OCA

如图2所示，FT-IR光谱显示，原料胭脂虫红酸其在3 400 ～2 500 cm-1范围内有一个宽而强的羟基（—O—H）引起的伸缩振动吸收峰，这是由于其分子结构中含有α-糖苷基团；
而其氧化产物OCA在3 372 cm-1处的O—H伸缩振动吸收峰明显变弱变窄，说明与胭脂虫红酸相比，OCA结构中的—OH数目减少；
同时，OCA在2 921 cm-1和2 858 cm-1处的甲基或亚甲基的C—H的伸缩振动吸收峰明显增强；
OCA在1 731 cm-1的吸收峰是典型的C＝O伸缩振动，1 196 cm-1和1 100 cm-1处的强吸收峰分别是由C—O—C引起的伸缩振动和弯曲振动，说明OCA中可能含有羰基和酯基，而胭脂虫红酸在1 717 cm-1处的C＝O吸收峰是其分子中的羰基和羧基引起的伸缩振动。此外，OCA在1 594 cm-1处的吸收峰是芳香族化合物C＝C的典型伸缩振动，1 373 cm-1和1 337 cm-1处是C—H的伸缩振动，886 cm-1和770 cm-1是芳香族化合物C—H的伸缩振动吸收峰。FT-IR光谱分析结果表明OCA结构中含有苯环、羟基、羰基和酯基等基团[23-24]。

2.1.2 XPS分析

如图3所示，胭脂虫红酸基OCA的XPS图显示其在283.6 eV和532.2 eV处分别有C1s和O1s的特征峰，说明OCA主要由C和O元素组成；
而在620.5 eV和630.0 eV处有碘元素的3d5和3d3特征峰，这可能是氧化剂高碘酸钾的无机还原产物掺杂在OCA引起的。C1s分峰拟合表明存在C—C/C—H（284.82 eV）、C—O（286.54 eV）和C＝O（288.81 eV），O1s分峰拟合表明存在C＝O（532.40 eV）和C—O（533.49 eV）。XPS鉴定的OCA组分与FT-IR结果一致，表明OCA的结构具有芳香族化合物的结构，其表面含有羰基、酯基和羟基等官能团，可为金属离子或者小分子的识别提供位点[25-26]。

图3 OCA的XPS（A）及C1s（B）、O1s（C）的XPS拟合分峰图Fig. 3 XPS spectra of OCA and fitted curves of peaks C1s and O1s

2.1.3 TEM和DLS分析

如图4所示，TEM和DLS测试结果表明OCA呈椭圆形球状的纳米颗粒，粒子分布较为均一，这些微粒的平均粒径约为（7.5±1.3）nm。这是因为胭脂虫红酸分子结构中含有α-糖苷和多羟基蒽醌基团，在强氧化剂高碘酸钾的作用下，分子中的邻二羟基的碳碳键断裂，醇羟基转化成相应的醛、酮和羧酸；
进一步，在高温高压条件下，醛、酮、羧酸基团脱水缩合并聚合形成纳米颗粒，即目标产物OCA[21-22]。

图4 OCA的TEM和粒径分布图Fig. 4 TEM and particle size distribution of OCA

2.2 OCA的光学性质

如图5所示，UV-vis光谱显示OCA的最大吸收峰位于225 nm处，这可能归因于其表面官能团的n→π*跃迁。荧光测试结果表明，OCA的荧光最大激发波长（λEx）和最大发射波长（λEm）分别位于336 nm和445 nm处；
在最大发射波长处，OCA的荧光强度为8 989，在室内自然光下，OCA呈浅黄色溶液，在365 nm光照射下发射明亮的蓝色荧光。以荧光产率为89%的罗丹明B作为标准参照物，测得OCA的荧光量子产率为5.2%。

图5 OCA的光学性质Fig. 5 Optical properties of OCA

2.3 环境pH值对OCA荧光性能的影响

图6 环境pH值对I-CDs荧光性能的影响Fig. 6 Effect of pH on fluorescence intensity of I-CDs

如图6所示，与空白对照组（pH 7）相比，OCA在酸性环境下荧光发射的最大波长均为445 nm左右，发射范围位于380～620 nm区间，且荧光强度稍有增强；
然而，当其在pH值大于9的碱性环境中，荧光强度显著降低，荧光发射峰宽度明显缩小且发射范围减小至390～605 nm区间。OCA在不同pH值环境中呈现的荧光差异可能是由于其表面有大量酚羟基，该基团在酸性溶液中不会电离，但是在碱性溶液中容易电离导致电荷的分布改变而影响其共轭结构，致使其荧光减弱[27]，因此，当以OCA为荧光传感器用于检测时使用的pH值范围应控制在1～9之间。

2.4 阴离子对OCA荧光的影响

如图7所示，与空白组相比，所考察的10种常见阴离子对OCA溶液的荧光强度没有明显改变，说明OCA在不同阴离子溶液中稳定性良好。

图7 阴离子对OCA荧光性能的影响（各阴离子浓度均为1.0 mmol/L）Fig. 7 Effect of anions on fluorescence intensity of OCA (at anion concentration of 1.0 mmol/L)

2.5 OCA对铁离子（Fe3+）的选择性

图8 OCA对Fe3+离子的选择性（各阳离子浓度均为1.0 mmol/L）Fig. 8 Selectivity of OCA toward iron ions (at cation concentration of 1.0 mmol/L)

如图8所示，考察蘑菇中常见的17种阳离子对OCA荧光的影响，结果表明，除Fe3+加入后溶液的荧光强度显著降低外，其他阳离子均未能使OCA的荧光发生明显的改变，说明所合成的OCA对Fe3+离子具有较高的选择性[27]。这可能是因为Fe3+离子与OCA的表面酚羟基络合，在光照条件下二者发生了电子转移，OCA表面的电子云密度发生变化从而导致其荧光减弱，且这种减弱趋势与Fe3+浓度有关，因此，OCA对Fe3+具有选择性。

为了进一步考察其他金属离子对Fe3+的干扰作用，进行抗干扰实验。如图9所示，与空白样相比，在含有Fe3+的OCA溶液中加入其他金属离子时并未明显改变体系的荧光强度，说明OCA对Fe3+选择性识别的抗干扰性较强，具有开发成为荧光传感器用于检测Fe3+的潜在应用。

图9 其他金属离子对OCA识别Fe3+的影响（各金属离子浓度均为1.0 mmol/L）Fig. 9 Effects of other metal ions at a concentration of 1.0 mmol/L on iron ion recognition by OCA

如图10所示，向3.0 mL OCA溶液中加入1.0 mL浓度为1.0 mmol/L的Fe3+溶液，溶液荧光立即减弱，但随着二者混合作用时间的延长溶液的荧光强度略有增加，当反应时间至30 min，二者的荧光体系趋于稳定，且稳定时间超过2 h。因此，当以OCA为荧光传感器检测Fe3+时，应按照1.3.7节方法将OCA与被测样品混合15 min，然后再超声15 min后再进行荧光检测。

图10 OCA与Fe3+作用时间对体系荧光强度的影响（PMT为750 V）Fig. 10 Effect of reaction time between OCA and Fe3+ on fluorescence intensity of the system (PMT was 750 V)

2.6 OCA应用于Fe3+的检测

如图11所示，OCA溶液中加入氯化铁溶液后荧光强度明显降低，且随着Fe3+质量浓度增加，OCA的荧光强度逐渐减小，但是最大发射峰位置没有发生改变，说明Fe3+加入后只与OCA表面的基团发生了相互作用而改变电荷分布，但是没有改变OCA的内部共轭结构，因此，可以开发OCA作为荧光传感器用于Fe3+的检测。OCA位于380～620 nm处的荧光发射峰积分面积减小率与Fe3+质量浓度在11.2～56.0 mg/L范围内具有良好的线性关系（R2=0.998），对线性拟合可得标准工作曲线方程y=0.549x-0.039，检出限为2.5 mg/L（RSN=3）。

图11 不同质量浓度Fe3+条件下OCA的荧光谱图Fig. 11 Fluorescence spectra of OCA at different concentrations of Fe3＋

基于Fe3+对OCA荧光减弱作用，采用荧光分析法测定香菇、白菇和杏鲍菇的Fe3+含量。如表1所示，与ICP-MS标准方法相比较，基于OCA作为荧光传感器的荧光检测方法用于实际样品中Fe3+的检测，样品回收率在95.3%～110.4%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在2.3%～4.6%之间，表明该方法可用于香菇、白菇和杏鲍菇等蘑菇中Fe3+的含量检测，方法可靠。

表1 实际样品中Fe3+的检测结果（n=3）Table 1 Results of detection of Fe3+ in real samples (n = 3)

以胭脂虫红酸为原料，高碘酸钾为氧化剂，在乙醇/水热法一步合成水溶性的可发射蓝色荧光的OCA，通FT-IR和XPS分析结构表明OCA结构中含有共轭的芳香环结构和大量含氧官能团；
TEM和DLS分析结果表明OCA的平均粒径约为7.5 nm。

光学性质测试结果表明，OCA的荧光最大激发波长为336 nm，最大发射波长为445 nm，发射范围位于380～620 nm区间；
UV-vis测试结果显示其在波长225 nm处有最大吸收峰；
当以OCA为荧光传感器用于检测时使用的pH值范围应控制在1～9之间，且OCA在不同阴离子溶液中稳定性良好。

OCA对Fe3+有良好的选择性，加入Fe3+会导致其荧光强度明显降低，位于380～620 nm区间的荧光发射峰积分面积减小率与Fe3+质量浓度在11.2～56.0 mg/L范围内具有良好的线性关系，检出限为2.5 mg/L。应用结果表明，基于OCA作为荧光传感器的荧光检测方法用于实际样品中Fe3+的检测，样品回收率在95.3%～110.4%之间，RSD在2.3%～4.6%之间，表明该方法可用于香菇、白菇和杏鲍菇等蘑菇中Fe3+的含量检测，方法可靠。

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