野生和栽培岩黄连的显微与薄层色谱鉴别研究
时间：2023-01-21 20:15:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
金书屹，韩 凤，陶 伟，罗 川，谢国勇*，秦民坚*
(1.中国药科大学 中药学院，江苏 南京 210009；
2. 重庆市药物种植研究所，重庆 南川 408435)
岩黄连作为我国壮族的民族药，中医认为其味苦、性凉，有清热解毒、利湿、止痛止血的功效[1-3]。在《中国植物志》中，峨眉黄连Coptis omeiensis（Chen）C. Y. Cheng、短莛黄堇Corydalis pseudorupestrisLiden et Z. Y. Su Act. Bot. Yunn、毛黄堇Corydalis tomentellaFranch.、川鄂黄堇Corydalis wilsoniiN. E. Brown 和石生黄堇Corydalis saxicolaBunting 均被称为岩黄连[2]，目前石生黄堇和毛黄堇在市场上作为岩黄连的流通最广。野生岩黄连资源稀缺，广西等地区已实现人工培育岩黄连，前期研究表明野生和栽培岩黄连的化学成分以及药理作用有一定的差异[4]，但关于野生和栽培岩黄连的显微差异并未见详细报道。因此，本研究以石生黄堇和毛黄堇两种植物为主要研究对象，收集了野生以及栽培药材，并对其进行生药学研究，旨在通过生药学鉴定来区别岩黄连不同的基原及来源，为进一步开发利用岩黄连资源提供参考依据。
野生和栽培岩黄连样品分别来自贵州、广西、云南、湖北等地，经中国药科大学谢国勇副教授鉴定，中国药科大学秦民坚教授复核，分别为石生黄堇Corydalis saxicolaBunting 以及毛黄堇Corydalis tomentellaFranch.，样品信息见表1。
表1 岩黄连药材样品信息Tab. 1 Sample information of Yanhuanglian
NIKON ECLIPSE E200 型显微镜[尼康映像仪器销售（中国）有限公司]；
HISTOSTAT 820 型石蜡切片机（美国Reichert 公司）；
NIKON D7500 型数码单反相机[尼康映像仪器销售（中国）有限公司]；
GZX-9240ME 型烘箱（上海精宏实验设备有限公司）；
BATHS HH-S4 型水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；
惠普超纯净水仪（四川优普超纯科技有限公司）；
KH5200DB 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；
ZF-I 型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；
巴马丁、脱氢卡维丁标准品（成都植标化纯生物技术有限公司）；
甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司）；
正丁醇、乙酸（南京化学试剂有限公司）。
2.1 横切面鉴定
每种岩黄连药材取三份，分别对其根、茎、叶柄、叶片进行横切，放入新鲜配制的FAA 固定液中（福尔马林∶乙酸∶50%乙醇 = 1 ∶1 ∶18），24 h 后进行更换，将固定好的材料进行石蜡包埋切片，之后使用番红-固绿染色。置于显微镜下观察并拍照，同时记录特征信息。
2.2 粉末鉴定
每种岩黄连药材取五份，分别对其根、茎、叶进行粉碎，将粉末用水合氯醛透化两次后进行装片，在显微镜下观察拍照。
2.3 薄层色谱鉴定
准确称量每种岩黄连0.3 g，加入83%甲醇18 mL，超声提取32 min，提取两次，过滤后蒸干，残渣加入1 mL 的甲醇溶解，作为供试品。另取巴马丁、脱氢卡维丁适量，加入甲醇制成1 mg/mL 的对照品溶液。根据薄层色谱法改良[1,5-6]，分别吸取以上溶液各5 μL，点在同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇∶乙酸∶水= 7 ∶1 ∶2 为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯下365 nm 进行观察拍照。
3.1 横切面特征
3.1.1 野生石生黄堇 根：木栓层有时残留，皮层散有石细胞；
维管束外韧型，韧皮部较窄，木质部占大部分，射线较宽，导管呈放射状排列，木质部导管束多束，中央有髓，薄壁细胞不规则（图1A）。茎：表皮由1 列横向稍延长的细胞构成，表皮外附有角质层；
皮层宽，皮层细胞卵圆形或不规则形；
维管束10 个以上，外韧型；
中央有髓，薄壁细胞大呈类圆形（图1E）。叶柄：表皮由1 列类方形细胞构成，表皮外附有角质层；
薄壁细胞较大，类圆形；
维管束包埋在薄壁组织中，维管束不定，3 ～ 5 个，外韧型（图1I）。叶：上、下表皮均由1 列横向稍延长的细胞构成，上表皮细胞较大；
栅栏组织为长方形细胞；
海绵组织由形态不规则的细胞组成；
维管束在下表皮处微凸起，外韧型（图1M）。
3.1.2 栽培石生黄堇 根：木栓层有时残留，皮层散有石细胞；
维管束外韧型，韧皮部较窄，木质部占横切面1/2 左右，导管呈放射状排列；
木质部导管束多束，中央无髓。薄壁细胞不规则（图1B）。茎：表皮由1 列横向稍延长的细胞构成，表皮外附有角质层；
皮层宽，皮层细胞不规则形；
维管束5 ～ 8 个，外韧型；
髓部髓占切面的1/2 左右，薄壁细胞不规则形（图1F）。叶柄：表皮由1 列不规则形细胞构成，薄壁细胞不规则形；
维管束包埋在薄壁组织中，维管束不定，2 ～ 4 个，外韧型（图1J）。叶：上、下表皮由1 列横向稍延长的细胞组成，上表皮细胞较大；
栅栏组织不发达；
海绵组织由不规则细胞形细胞组成；
维管束在下表皮处凸起，外韧型（图1N）。
3.1.3 野生毛黄堇 根：木栓层有残留，皮层散有石细胞；
维管束外韧型，韧皮部较窄，木质部占横切面2/3，导管呈放射状排列；
木质部导管束2 束，中央无髓。薄壁细胞不规则（图1C）。茎：表皮由1 列类方形的细胞构成，表皮外附有角质层；
皮层较宽，皮层细胞不规则形；
维管束10 个以上，外韧型；
髓部髓占切面的1/2 左右，薄壁细胞大呈不规则形（图1G）。叶柄：表皮由1 列类方形细胞构成，表皮外附有角质层；
薄壁细胞较大，不规则形；
维管束包埋在薄壁组织中，维管束不定，5 ～ 8 个，外韧型（图1K）。叶：上、下表皮由1 列纵向稍延长的细胞组成，上表皮细胞较大；
表皮有非腺毛；
栅栏组织不发达；
海绵组织由不规则细胞形细胞组成；
维管束在下表皮处凸起，外韧型（图1O）。
3.1.4 栽培毛黄堇 根：木栓层有残留，皮层散有石细胞；
维管束外韧型，韧皮部较窄，木质部占横切面1/2，导管呈放射状排列；
木质部导管束4 束，中央无髓。薄壁细胞类方形（图1D）。茎：表皮由 1 列类方形的细胞构成，表皮外附有角质层；
皮层较宽，皮层细胞不规则形；
维管束外韧型；
髓部髓占切面的1/2 左右，薄壁细胞大呈不规则形（图1H）。叶柄：表皮由 1 列横向延长的细胞构成，表皮外附有角质层；
薄壁细胞较大，不规则形；
维管束包埋在薄壁组织中，维管束不定，5 ～ 8 个，外韧型（图1L）。叶：上、下表皮由1 列类圆形的细胞组成，上表皮细胞较大；
表皮有非腺毛；
栅栏组织不发达；
海绵组织由不规则细胞形细胞组成；
维管束在下表皮处微凸起，外韧型（图1P）。
3.2 粉末特征
3.2.1 野生石生黄堇 根：棕褐色，偶见石细胞，呈方形、类圆形、不规则形，可见纹孔和层纹；
纤维较少，长100 ～ 150 μm，可见层纹；
网纹导管直径10 ～ 50 μm；
木栓组织表面观类长方形，壁不均匀增厚（图2A）。茎：棕色，偶见石细胞，呈方形、类圆形、不规则形，可见纹孔和层纹；
纤维多成束，长70 ～ 150 μm，可见层纹；
网纹导管直径10 ～50 μm；
木栓组织表面观类长方形，壁不均匀增厚 （图2E）。叶：墨绿色，偶见纤维，长200 ～ 250 μm；
螺纹导管直径5 ～ 25 μm，上下表皮细胞表面观呈多角形，上表皮有蜡质结构。上表皮垂周壁平直，下表皮垂周壁浅波状，下表皮有气孔主为不定式和不等式，副卫细胞大多为4 ～ 5 个（图2I）。
3.2.2 栽培石生黄堇 根：棕黄色，纤维长150 ～200 μm，可见层纹；
网纹导管直径10 ～ 40 μm，木栓组织表面观类不规则，壁不均匀增厚 （图2B）。茎：黄绿色，纤维长200 ～ 300 μm，可见层纹；
网纹导管较多见，直径10 ～ 30 μm，螺纹导管较少见，直径20 ～ 40 μm；
木栓组织表面观类不规则形，壁不均匀增厚 （图2F）。叶：黄绿色，螺纹导管直径5 ～15 μm，草酸钙结晶存在在叶肉薄壁细胞中，方晶直径5 ～ 10 μm，上表皮细胞细胞表面观呈类圆形，下表皮细胞细胞表面观呈多角形，上表皮垂周壁平直，下表皮垂周壁浅波状，下表皮有气孔，主为不定式和不等式，副卫细胞大多为4 ～ 5 个；
淀粉粒甚多，单粒类圆形，复粒2 ～ 3 个，直径5 ～ 15 μm （图2J）。
3.2.3 野生毛黄堇 根：棕色，草酸钙结晶存在在薄壁细胞中，方晶直径20 ～ 60 μm，网纹导管较多见，直径30 ～ 50 μm，螺纹导管较少见，直径5 ～10 μm；
木栓组织表面观类方形，壁不均匀增厚 （图2C）。茎：黄绿色，具有晶纤维和纤维，纤维长200 ～300 μm，网纹导管较多见，直径20 ～ 40 μm，螺纹导管较少见，直径20 ～ 40 μm，木栓组织表面观类不规则形，壁不均匀增厚 （图2G）。叶：黄绿色，草酸钙结晶存在在叶肉薄壁细胞中，方晶直径10 ～ 20 μm；
螺纹导管直径5 ～ 10 μm；
上表皮细胞细胞表面观呈类圆形，上表皮有蜡质结构，下表皮细胞细胞表面观呈多角形，上表皮垂周壁平直，下表皮垂周壁浅波状，下表皮有气孔，主为不定式和不等式，副卫细胞大多为4 ～ 5 个。非腺毛细胞，长150 ～ 250 μm （图2K）。
3.2.4 栽培毛黄堇 根：棕褐色，网纹导管直径30 ～ 50 μm，木栓组织表面观长方形，壁不均匀增厚（图2D）。茎：棕黄色，纤维长300 ～ 500 μm；
网纹导管直径20 ～ 40 μm，木栓组织表面观类不规则形，壁不均匀增厚 （图2H）。叶：黄绿色，草酸钙结晶存在在叶肉薄壁细胞中，方晶直径5 ～ 10 μm，螺纹导管直径5 ～ 10 μm；
上表皮细胞细胞表面观呈类圆形，上表皮有蜡质结构，下表皮细胞细胞表面观呈多角形，上表皮垂周壁平直，下表皮垂周壁浅波状，下表皮有气孔，主为不定式和不等式，副卫细胞大多为4 ～ 5 个；
非腺毛细胞，长150 ～ 250 μm。非腺毛细胞，长150 ～ 250 μm （图2L）。
3.3 薄层色谱鉴别
按照“2.3”项下方法处理12 批不同基原的野生和栽培岩黄连以及对照标准品，并按照“2.3”项下薄层色谱条件进行点样，展开以及显色，薄层色谱图见图3。从薄层色谱的结果得知，不同批次的岩黄连中主要的斑点共有4 个：自下而上为Rf 值0.44 的黄色斑点，Rf 值0.47 的黄色斑点，Rf 值0.48 的黄绿色斑点，Rf 值0.54 的黄色斑点。薄层色谱的结果表明不同来源的岩黄连具有明显的区别：野生石生黄堇在Rf值为0.50 处有蓝色斑点，毛黄堇在Rf 值为0.23 处有蓝色斑点，栽培毛黄堇在Rf 值为0.66 处有红色斑点。
3.4 不同基原的野生和栽培岩黄连的特征对比
为了方便对比不同基原的野生和栽培的岩黄连，综合显微鉴别和薄层色谱鉴别信息，见表2。
表2 不同基原的野生和栽培岩黄连的特征对比Tab. 2 Comparison of characteristics of wild and cultivated Yanhuanglian from different origin
通过对比不同器官的解剖特征发现野生和栽培岩黄连存在一定的差异，野生石生黄堇根的中央具有髓部，而其它来源的岩黄连则不具备。髓部是由薄壁细胞组成，可特化为贮水组织，从而使植物适应干旱的环境[7-8]，这可能是因为野生石生黄堇生长在岩石缝隙中缺少水分而形成的。野生岩黄连的茎也比栽培岩黄连具有更多的维管束，推测与野生岩黄连的生长环境有关：野生岩黄连生长在野外，需要更多的维管束提供水分和养分以保证植株的生长需求。野生石生黄堇的叶具有栅栏组织，而其它来源的岩黄连大多不具有，这可能是由于栅栏组织是叶肉组织中因为光合作用而特化出的一类细胞，干旱、气温都会对栅栏组织的形成有一定的影响[9-10]，栽培岩黄连大多是一年生植物，而野生石生黄堇则是多年生植物，多次经历低温和干旱的胁迫，因此特化出栅栏组织适应各种非生物胁迫。
野生石生黄堇的根和茎的粉末中可见石细胞，而其它来源岩黄连的根和茎中未见明显的石细胞；
石细胞是由于薄壁细胞的细胞壁木质化增厚形成，主要具有增强植物体的机械强度的作用，机械强度的增加有利于野生石生黄堇的生长。野生毛黄堇的根中有网纹和螺纹两种类型的导管，而其它来源岩黄连的根中只有网纹导管。毛黄堇的叶粉末中可见明显的非腺毛，这个特征可以区分石生黄堇和毛黄堇，在栽培毛黄堇的茎中可见到草酸钙结晶。
在薄层色谱中，毛黄堇在Rf 值较小段有蓝紫色斑点，而石生黄堇中却没有，此蓝紫色的斑点可以区别石生黄堇和毛黄堇，栽培毛黄堇在Rf 值较大段有红色斑点，而野生毛黄堇中却不具备，此红色斑点可区别野生和栽培毛黄堇。
目前对于岩黄连的生药学鉴定研究较少，且尚未有完整的标准，尽快完善鉴定标准对岩黄连的开发利用具有重要意义。不同基原的野生和栽培岩黄连的药效具有一定的差异[4]，因此选择合适的来源对于后期的研究具有重要意义，本研究主要从生药学鉴定方面出发，找到了不同来源岩黄连的差异，为不同来源岩黄连的差异提供了一定的物质基础，也为岩黄连的药材质量标准的建立提供了依据。
通过组织切片、粉末鉴定和薄层色谱法对比不同基原的野生和栽培岩黄连的显微特征，为岩黄连的显微鉴定提供一定的理论基础，为岩黄连的鉴别及质量标准的建立提供参考。但由于岩黄连分布较广泛、数量较少且难以采摘，因此对于不同产地的岩黄连的收集较少，之后会进一步研究不同产地之间的特征差异，以期为岩黄连的鉴定提供更为全面的材料支持。
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