【血清饥饿法同步化牛卵巢颗粒细胞周期的研究】 血清饥饿法特点

　　 　　摘要：研究了体细胞制备过程中细胞培养时间、血清饥饿浓度和饥饿时间对体细胞周期同步化的影响。体细胞为牛卵巢颗粒细胞，细胞用碘化丙啶（PI）染色法，用流式细胞仪检测细胞周期。细胞传代培养至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％的血清饥饿浓度下诱导处理２、３、４和５ ｄ。试验结果表明，第２、１０和２５代的细胞在Ｇ０／Ｇ１期的比例没有差异（Ｐ＞０．０５）。培养液中添加０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ较对照组（１０％ ＦＣＳ）提高了细胞Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５），０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ试验组获得了相近的细胞Ｇ０／Ｇ１期比例（Ｐ ＞ ０．０５）。血清饥饿至第5天的细胞较第2天的细胞有高的Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５）。结果显示，体外培养至不同代的牛卵巢颗粒细胞对Ｇ０／Ｇ１期的比例没有影响，血清饥饿和延长血清饥饿的时间能够有效诱导体细胞进入Ｇ０／Ｇ１期。
　　关键词：牛；颗粒细胞；血清饥饿；同步化；细胞周期
　　中图分类号：Ｑ８１３；Ｓ８２３．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）08－1632-04
　　自１９９７年克隆绵羊Ｄｏｌｌｙ诞生以来，体细胞克隆技术得到了飞速的发展，已在许多动物中获得了成功［１－４］。在体细胞克隆研究中，供体细胞的选择和制备是提高体细胞克隆效率的关键步骤［５，６］。研究者从供体细胞的类型、供体来源、培养时间、核质同步化处理方法、培养液组成等方面进行了大量研究，以期获得最好的供体细胞来提高体细胞克隆的效率。在体细胞克隆过程中，供体细胞和受体细胞核质同步化是影响克隆效率的一个关键因素。处于Ｇ０／Ｇ１期的供体细胞通常被认为是理想的进行克隆研究的供体细胞，血清饥饿是诱导供体细胞进入Ｇ０／Ｇ１期阶段的主要方法［７－９］。虽然人们尝试使用不同的血清浓度和不同的血清饥饿时间来诱导供体细胞进入Ｇ０／Ｇ１期，也取得了不错的试验结果［１０，１１］，但很少将血清饥饿浓度、饥饿时间及细胞传代阶段与细胞周期的同步化做深入的关联分析研究。该试验研究了牛卵巢颗粒细胞制备过程中不同的血清浓度、血清饥饿时间以及体外培养时间对细胞周期同步化的影响。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　黄牛卵巢采自贵阳市某屠宰场；胎牛血清购自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、DMEM、青霉素、链霉素、DMSO和透明质酸购自Hyclone公司；RNaseA、碘化丙啶（PI）和TritonX-100购自南京凯基生物工程有限公司。
　　１．2牛卵巢颗粒细胞制备
　　黄牛卵巢从屠宰场收集后装入加有１００ ＩＵ/ｍＬ 链霉素和１００ ＩＵ／ｍＬ青霉素的３０℃ 的ＤＰＢＳ中，于４ ｈ内运回实验室。将卵巢带回实验室后以ＤＰＢＳ清洗２次，从卵巢表面抽取卵泡液，取２ ｍＬ卵泡液用等量的０．２％透明质酸酶消化３ ｍｉｎ，用ＤＭＥＭ离心洗涤（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，然后用ＤＭＥＭ调整颗粒细胞的密度为１×１０６个／ｍＬ，将颗粒细胞移入加体积分数１０％ＦＣＳ、２ ｍmｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、１００ ＩＵ／ｍL青霉素和链霉素的ＤＭＥＭ中进行培养。待细胞长至８０％～９０％时进行细胞消化传代培养。细胞消化用含０．１％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ的消化液，在３７．５℃下进行。细胞冷冻保存液是含有２０％（V／V） ＦＣＳ和５％ ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ。颗粒细胞培养至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％ FCS浓度下分别处理２、３、４和５ ｄ以诱导颗粒细胞进入Ｇ０／Ｇ１期。
　　１．3ＰＩ染色法检测细胞周期
　　培养的牛卵巢颗粒细胞在３７．５ ℃下用０．１％胰蛋白酶和０．０２％ ＥＤＴＡ的消化液消化处理，然后移入５ ｍL离心管中用 ＤＰＢＳ离心洗涤（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，再用ＤＰＢＳ调整细胞浓度，使每个离心管中细胞的数目达到１×１０５个。细胞在４ ℃ 条件下加入３ ｍL预冷的 ７０％ 乙醇进行固定，过夜。固定后的细胞用提前预冷的ＤＰＢＳ洗涤离心２次，然后在每管中加入含有１ ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ 的０．５ ｍＬ ＰＢＳ，在３７ ℃的水浴中处理３０ ｍｉｎ。细胞染色是在４ ℃ 条件下以０．１ ｍｇ／ｍＬ ＰＩ 和０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００避光处理２ ｈ。染色处理结束的细胞用流式细胞仪检测其细胞周期。
　　１．4试验方法
　　１．4．１培养时间对体外培养的牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期的影响探讨牛卵巢颗粒细胞体外培养时间对其细胞周期的影响，分别将培养至第２、１０和２５代的牛卵巢颗粒细胞用０．５％ ＦＣＳ饥饿诱导处理２ ｄ，然后用ＰＩ染色法处理细胞，用流式细胞仪检测不同培养时间细胞的细胞周期。
　　１．4．２不同浓度的FCS对牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期的影响探讨血清饥饿在对诱导体外培养的牛卵巢颗粒细胞进入Ｇ０／Ｇ１期的影响，将体外培养至第５代的牛卵巢颗粒细胞分别用含０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ的培养液诱导处理２ ｄ，对照组为１０％ ＦＣＳ。然后用ＰＩ染色法处理细胞，用流式细胞仪检测不同试验处理细胞的细胞周期。
　　１．4．３血清饥饿时间对牛卵巢细胞Ｇ０／Ｇ１期的影响探讨血清饥饿时间对诱导体外培养的牛卵巢颗粒细胞进入Ｇ０／Ｇ１期的影响，将体外培养至第５代的牛卵巢颗粒细胞用含０．５％ ＦＣＳ的培养液分别处理２、３、４和５ ｄ，然后用ＰＩ染色法处理细胞，用流式细胞仪检测不同处理细胞的细胞周期。
　　１．5统计分析
　　数据采用ＳＰＳＳ １１．５软件分析，结果以平均数±标准差来表示。
　　２结果与分析
　　２．１培养时间对牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期的影响
　　将培养至第２、１０和２５代的牛卵巢颗粒细胞用０．５％ ＦＣＳ饥饿诱导处理２ ｄ，不同培养时间对其细胞周期的影响见表１。第２、１０和２５代牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期的百分比分别为８２．６％、８４．７％和８３．８％，各组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）。
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　２．２不同浓度的FCS对牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期的影响
　　将体外培养至第５代的牛卵巢颗粒细胞用加有０．５％ ＦＣＳ 和０．０５％ ＦＣＳ 的培养液诱导处理２ ｄ，不同浓度的ＦＣＳ对牛卵巢颗粒细胞进入Ｇ０／Ｇ１期的影响见表２。由表2可知，０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ试验组较对照组显著提高了Ｇ０／Ｇ１期细胞的百分比（Ｐ＜０．０５），但试验组间差异不显著（Ｐ＞０．０５），两者均获得了比较高比例的Ｇ０／Ｇ１期细胞，但对照组（１０％ ＦＣＳ）仅有６２．４％的细胞处于Ｇ０／Ｇ１期。
　　２．３血清饥饿时间对牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期的影响
　　将体外培养至第５代的牛卵巢颗粒细胞用加有０．５％ ＦＣＳ的培养液分别处理２、３、４和５ ｄ，饥饿时间对诱导体外培养的牛卵巢颗粒细胞进入Ｇ０／Ｇ１期的影响见表３。从表3中可以看出，随着饥饿处理时间的增加，Ｇ０／Ｇ１期细胞的百分比呈现逐渐上升的趋势。饥饿处理５ ｄ较２ ｄ显著提高了Ｇ０／Ｇ１期细胞的百分比（Ｐ＜０．０５），饥饿处理２ ｄ和５ ｄ后的Ｇ０／Ｇ１期细胞的百分比分别为８１．２％和８７．６％。
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　３小结与讨论
　　体细胞克隆技术中供体细胞的细胞周期和受体细胞核质同步化是影响克隆效率的一个关键因素。供体细胞处于Ｇ０／Ｇ１阶段有益于供体细胞和受体细胞的核质同步化以及重构胚的再程序化，而且能够正常的浓缩染色体，在第一次细胞分裂的末期维持正常的染色体倍数［１２］。在长期的研究中，人们采用了几种不同的研究方法得到处于Ｇ０／Ｇ１阶段的供体细胞［１３，１４］。在供体细胞的细胞周期同步化中，人们常以血清饥饿诱导供体细胞进入Ｇ０／Ｇ１期。在牛成纤维细胞的研究中，通过０．０５％浓度的血清诱导供体细胞取得了成功，同时通过延长低浓度血清诱导成纤维细胞的时间，提高了Ｇ０／Ｇ１阶段细胞的比例［１5］。在当前的研究中，０．５％和０．０５％浓度的ＦＣＳ在诱导牛卵巢颗粒细胞获得高比例Ｇ０／Ｇ１期细胞方面没有显著差异，但０．５％和０．０５％的ＦＣＳ较１０％的ＦＣＳ显著提高了牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期细胞的比例。这表明低浓度的血清诱导可以提高牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期的比例，但不同水平的低浓度血清对诱导牛卵巢颗粒细胞进入Ｇ０／Ｇ１期没有影响。结合以前的研究报道和本试验的结果，我们发现并非血清饥饿就可以诱导体细胞获得高比例的Ｇ０／Ｇ１期，这中间除了有不同实验室工作环境和操作工艺存在差别的原因外，可能还与细胞类型及细胞来源有关。本研究中，通过延长０．５％浓度ＦＣＳ对牛卵巢颗粒细胞的诱导时间，发现饥饿处理５ ｄ的牛卵巢颗粒细胞较处理２ ｄ的牛卵巢颗粒细胞均获得了较高的Ｇ０／Ｇ１期细胞百分比。在对牛成纤维细胞的血清饥饿诱导研究中有和本试验的结果基本一致，研究人员将血清饥饿的时间延长至１４ ｄ，得到了高比例的Ｇ０／Ｇ１期牛成纤维细胞［１６］。以前的研究和我们的试验结果说明通过延长血清饥饿的时间同样可以获得高比例的Ｇ０／Ｇ１期供体细胞。
　　在体细胞克隆研究中，人们发现Ｄｏｌｌｙ的端粒长度明显短于同龄羊，而与供体乳腺细胞的端粒长度相当。这就提出了一个问题，体细胞克隆动物是否会遗传供体核缩短了的端粒给后代，从而导致过早衰老。但之后几年大量的研究表明，端粒复原存在于大部分克隆动物中，端粒缩短可能不是造成克隆动物高死亡率的最主要原因。但在供体细胞体外制备过程中，人们又在担心体外长期培养的细胞可能会给供体细胞本身和重构胚体外培养带来负面影响。而且有人认为供体细胞衰老对重构胚的发育潜能有影响，所以通常选择体外培养短期阶段的体细胞进行克隆［１７］。但大量的研究也表明，体外长期培养的细胞在重构胚构建及重构胚发育方面优于短期培养的细胞［１８］。在本试验中，培养至第２、１０和２５代的牛卵巢颗粒细胞均获得了相近比例的Ｇ０／Ｇ１期细胞。这表明体外培养的牛卵巢颗粒细胞是否衰老对通过血清饥饿诱导细胞获得Ｇ０／Ｇ１期细胞的比例没有影响。因此，在牛卵巢颗粒细胞制备用作供体细胞的研究中，血清饥饿诱导可以提高细胞Ｇ０／Ｇ１期的比例，但不同水平的低浓度血清对诱导牛卵巢颗粒细胞进入Ｇ０／Ｇ１期没有影响，延长饥饿诱导的时间可以提高Ｇ０／Ｇ１期细胞的比例；体外传代时间对牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期细胞比例的影响不显著。
　　参考文献：
　　［１］ ＣＨＥＳＮＥ Ｐ， ＡＤＥＮＯＴ Ｐ Ｇ， ＶＩＧＬＩＥＴＴＡ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｅｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００２，２０：３６６－３６９．
　　［２］ ＳＨＩＮ Ｔ， ＫＲＡＥＭＥＲ Ｄ， ＰＲＹＯＲ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃａｔ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ， ２００２，４１５（６８７４）：８５９．
　　［３］ ＧＡＬＬＩ Ｃ， ＬＡＧＵＴＩＮＡ Ｉ， ＣＲＯＴＴＩ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｌｏｎｅｄ ｈｏｒｓｅ ｂｏｒｎ ｔｏ ｉｔｓ ｄａｍ ｔｗｉｎ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２４（６９４９）：６３５．
　　［４］ ＩＲＩＮＡ Ｌ， ＧＩＯＶＡＮＮＡ Ｌ， ＲＯＢＥＲＴＯ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｏｒｓｅｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｏｃｙｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｅｍｂｒｙｏ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ［Ｊ］． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ２００５，１３０：５５９－５６７．
　　［５］ ＫＯＯ Ｄ Ｂ， ＫＡＮＧ Ｙ Ｋ， ＣＨＯＩ Ｙ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｓ ｕｓｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，２００１，５８：１５－２１．
　　［６］ ＲＥＩＫ Ｗ， ＤＥＡＮ Ｗ， ＷＡＬＴＥＲ Ｊ． Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３（５５３２）：１０８９－１０９３．
　　［７］ ＷＩＬＭＵＴ Ｉ， ＳＣＨＮＩＥＫＥ Ａ Ｅ， ＭＣＷＨＩＲ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｖｉａｂｌｅ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｔａｌ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８５（６６１９）：８１０－８１３．
　　［８］ ＧＯＭＥＺ Ｍ Ｃ， ＪＥＮＫＩＮＳ Ｊ Ａ， ＧＩＲＡＬＤＯ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ ａｆｒｉｃａｎ ｗｉｌｄ ｃａｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｅｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｃａｔ ｏｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００３，６９：１０３２－１０４１．
　　［９］ ＬＩＵ Ｃ Ｔ， ＹＵ Ｋ Ｃ， ＪＵ Ｊ Ｃ． Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｓｔａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｆｏｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｒｅｐ Ｄｏｍ Ａｎｉｍ，２００４，３９：３８５－３９０．
　　［１０］ ＳＡＮＳＩＮＥＮＡ Ｍ Ｊ， ＨＹＬＡＮ Ｄ， ＨＥＢＥＲＴ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｂａｎｔｅｎｇ （Ｂｏｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ） ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００５，６３：１０８１－１０９１．
　　［１１］ ＬＩ Ｚ Ｙ， ＳＵＮ Ｘ Ｓ， ＣＨＥＮ Ｊ， ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎｅｄ ｆｅｒｒｅｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２００６，２９３：４３９－４４８．
　　［１２］ ＨＡＮ Ｚ， ＨＡＮ Ｚ Ｍ， ＣＨＥＮ Ｄ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｉａｎｔ ｐａｎｄａ， Ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ Ｌ． ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｌ，２００３，２７：３４９－３５３．
　　［１３］ ＺＯＵ Ｘ， ＷＡＮＧ Ｙ， ＣＨＥＮＧ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｏａｔｓ （Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ） ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｆｏｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，２００２，６１： １６４－１７２．
　　［１４］ ＨＡＹＥＳ Ｏ， ＲＡＭＯＳ Ｂ， ＲＯＤＲ′ＩＧＵＥＺ Ｌ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ ｉｓ ａｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｓ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｒｒｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｇ０／Ｇ１ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ，２００５，８７：１８１－１９２．
　　［１５］ ＨＩＬＬ Ｊ Ｒ，ＷＩＮＧＥＲ Ｑ Ａ， ＢＵＲＧＨＡＲＤＴ Ｒ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｂｏｖｉｎｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃｌｏｎｅｄ ｆｅｔｕｓ［Ｊ］． Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ，２００１，６７：１７－２６．
　　［１６］ ＫＡＴＳＫＡ Ｌ， ＢＯＣＨＥＮＥＫ Ｍ， ＫＡＮＩＡ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｂｏｖｉｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００２，５８：１７３３－１７４４．
　　［１７］ ＫＵＨＨＯＬＺＥＲ Ｂ， ＢＡＧＵＩＳＩ Ａ， ＯＶＥＲＳＴＲＯＭ Ｅ Ｗ． Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏａｔ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ， ２０００， ５３：１０７１－１０７９．
　　［１８］ ＤＩＮＮＹＥＳ Ａ， ＤＡＩ Ｙ， ＢＡＲＢＥＲ Ｍ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｒａｂｂｉｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００１，６４ （１）：２５７－２６３．