【BMP-2诱导MSCs修复无血运区半月板损伤的实验研究】 半月板怎么修复
时间：2019-05-22 03:20:28 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
资料与方法 实验动物：6～12个月龄新西兰大白兔36只，雌雄不限，体重2～3kg。 实验方法： ⑴自体纤维蛋白原的制备：用10ml无菌注射器自兔股动脉抽取动脉血约10ml，注入10ml无菌试管内，每个无菌试管内预先注入1ml的10%枸橼酸钠溶液并涂布整个试管壁，所得兔血经3200rpm离心10分钟后去除沉淀的血细胞，保留上清(即兔血浆)。向兔血浆中按体积比例5:1加入4℃的饱和硫酸铵溶液，立即出现乳白色的絮状沉淀。经3200rpm离心3分钟后去除上清，所得的乳白色沉淀即为兔的纤维蛋白原，-20℃保存备用。
⑵骨髓间充质干细胞的分离及培养：无菌条件下，从自体新西兰大白兔双侧股骨转子用骨髓穿刺针穿刺，10ml无菌注射器抽出骨髓约5ml，离心后标本从上至下依次为:稀释液层、呈乳白色絮状的有核细胞层、分离液层及管底的红细胞层，小心吸取富含有核细胞的界面层，骨髓间充质干细胞即包含在该层细胞中；用MDME培养基洗涤1次加入DMEM完全培养基制成单细胞悬液，计数细胞，测定细胞活力。以5×104/ml的密度接种于75ml培养瓶中，置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中。培养第2天首次换液，换液时将培养液中悬浮的细胞离心收集后置入原瓶内继续培养，以后隔天换液1次，倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况。
⑶纤维蛋白胶、骨髓间充质干细胞及BMP-2混合物的制作：原代骨髓间充质干细胞培养第10天左右，倒置显微镜下呈融合状，收集原代的MSCs，用DMEM培养液制成1×106/ml的细胞悬液，并将纤维蛋白原解冻后预加温至37℃，备用。向24孔板的的每孔中滴入100μl骨髓间充质干细胞悬液，加入200μl的纤维蛋白原溶解于细胞悬液中。再先后加入预先加热至37℃的40mmol/ml氯化钙溶液60μl及50IU/ml的凝血酶溶液40μl，然后置于37℃恒温箱中数分钟至纤维蛋白胶凝块形成，最后在置入半月板缺损处时快速用微量注射器将已溶于1μl无菌蒸馏水的5mgBMP-2注入其上，即制成纤维蛋白胶、骨髓间充质干细胞及BMP-2混合物。
⑷动物模型的制作：6～12个月龄新西兰大白兔36只，雌雄不限，体重2～3kg，随机分成A、B两组，每组18只。以质量分数25mg/ml的戊巴比妥钠对实验动物进行耳缘静脉注射麻醉(1ml/kg)。无菌条件下，取双膝髌韧带内侧弧形切口，沿髌骨内上缘至胫骨结节处切开皮肤，在髌韧带内侧切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，屈曲膝关节，以小拉钩显露半月板前角、体部及股骨髁软骨面，用无菌手术刀片于半月板体部无血运区作一长约0.5cm，宽约0.1cm纵形全层裂伤。A组(36膝)每只对其双膝随机采取一侧于半月板损伤区注入纤维蛋白胶(FG组)，另一侧为空白对照组(NT组)，对损伤区不做任何处理；B组(36膝)对其双膝随机采取一侧于半月板损伤区注入纤维蛋白胶与骨髓间充质干细胞混合物(FM组)，另一侧于膝关节半月板损伤区注入纤维蛋白胶+骨髓间充质干细胞+骨形态发生蛋白混合物(FMB组)，所有半月板损伤区均依靠凝胶的黏附性与缺损周围组织紧密黏连，不予缝合。逐层关闭切口，1-0线缝合，所有术肢不行固定。术后每只兔子给予8万U庆大霉素，连续7天。
⑸组织取材及检测方法：分别于术后4周、8周、12周以静脉气栓法将实验动物处死，分别取下半月板，修去多余的组织，半月板损伤区修复情况行大体观察、光镜组织学检查及电镜检查。①大体观察：观察伤口有无感染，关节有无充血、水肿及黏连；半月板损伤区的修复情况，纤维蛋白胶有无脱落，损伤区有无新生组织及其平整性、光泽度及其与周围组织的结合情况，将观察到的全部半月板愈合情况，按评定指标对其进行效果评定，并进行统计学分析。②光镜组织学检查：观察新生组织的结构组成，半月板损伤区纤维软骨的数量变化，基质分泌及胶原纤维的结构，以及FG支架的吸收情况，12周时行GAG组织化学染色，光学显微镜下观察修复组织中GAG染色的情况，以周围正常纤维软骨组织饱和着色定为100%，组织不着色定为0%，色度高低对应GAG含量，计算机HPIAS-1000高清晰度彩色病理图象分析系统进行分析，统计学处理。组织取材后，修剪组织块，制成切片，HE染色及甲苯胺蓝染色。
结 果
所有实验动物术后无感染，无死亡，术后1周内略有跛行，1周后恢复正常。
大体观察：所有动物关节无红肿，关节腔内有少许谈黄色关节液，清亮透明。关节囊无挛缩，无黏连，滑膜无充血，无水肿。①空白对照组(NT组)：术后4周，半月板纵行全层裂清晰可见，缺损处无填充物，表面凹凸不平，边缘清晰。术后8周，半月板缺损区有薄层膜性组织覆盖，边缘清楚，色泽灰暗。术后12周，半月板缺损区较前略有缩小，边缘不整齐，色泽较暗，缺损仍清晰可见。②单纯纤维蛋白胶组(FG组)：术后4周，半月板缺损区支架材料与周围组织未融合，支架部分塌陷，植入物表面无光泽，按压仅部分阻抗，缺损清晰可见。术后8周，半月板缺损区填充物无融合，部分缺损无填充，支架塌陷，按压无阻抗。术后12周，半月板缺损区范围缩小，底部有1/3纤维成分填充。③FG+MSCs组(FM组)：术后4周，半月板缺损区支架材料与周围组织部分融合，无明显塌陷，但表面缺乏光泽，按压部分阻抗。术后8周，半月板缺损区修复组织与周围组织融合尚可，按压部分阻抗，修复组织高度约为缺损的1/2。术后12周，半月板缺损区修复组织与周围软骨组织大部分融合，较前略有光泽，有一定阻抗，修复组织高度约为缺损的3/4。④FG+MSCs+BMP-2组(FMB组)：术后4周，半月板缺损区支架材料无脱落，与周围组织融合好，按压有阻抗，表面有光泽。术后8周，半月板缺损区修复组织与周围组织融合好，表面光滑，按压有阻抗，修复组织高度与周围组织相平。术后12周，修复组织与周围纤维软骨组织无明显界限，表面光滑，有光泽，按压阻抗与周围组织相似。
光镜组织学检查：①空白对照组(NT组)：在术后各观察期半月板始终未愈合，裂口边缘的软骨细胞处于低代谢状态，细胞体积小，软骨囊消失。②单纯纤维蛋白胶组(FG组)：术后4周半月板移植区仍见少量凝胶存在，少量纤维组织长入其中，可见少量成纤维细胞生长，创面边缘组织内的软骨细胞代谢缓慢，略有萎缩。8周时缺损处凝胶已很少，内见少量成纤维细胞，分布于裂口边缘，未见软骨细胞，有胶原纤维沉积。12周时，移植区己无凝胶，见少量成纤维细胞，胶原纤维排列紊乱。③FG+MSCs组(FM组)：术后4周，半月板移植区仍可见大量凝胶存在，有部分纤维组织长入，呈成纤维状，数量较FG组增多。8周时，凝胶基本消失，其内偶见软骨细胞。12周时，可见许多成纤维细胞，胶原纤维排列欠规则。④FG+MSCs+BMP-2组(FMB组)：术后4周移植区仍见凝胶存在，被纤维组织所充填，细胞形态呈成纤维状，数量多。术后8周，凝胶基本消失，术后12周有较多的胶原纤维形成，可见成团的软骨细胞，有软骨囊形成，并有较多的同源细胞群，愈合组织与正常组织之间以胶原纤维相连，没有间隙，胶原纤维排列规则。GAG组织化学染色结果：术后12周，缺损区修复组织及修复细胞周围可见甲苯胺蓝染以阳性物质，与周围正常纤维软骨组织GAG染色一致，表示为黏多糖物质，FG组及FM组基质染色较FMB组明显变浅且不均匀，经计算机病理彩色图象分析及统计学处理有统计学意义。
电镜检查：12周时，NT损伤边缘组织可见到调亡软骨细胞，胶原纤维粗细不等，排列不规则。FG组纤维软骨细胞有突起，细胞形状不规则，胶原纤维粗细不等，排列不规则。FM组纤维软骨细胞有突起，核糖体丰富，胶原纤维丰富排列规则。FMB组软骨细胞有突起，高尔基复合体及粗面内质网丰富，胶原纤维丰富，排列规则。FM组胶原与软骨细胞的形态明显好于FG组而不及FMB组。
统计学结果：在α=0.05的检验水准上，经Kruskal-Wallis检验，P＜0.05可以认为半月板愈合情况有差异。经两两比较不可以认为NT组与FG组、NT组与FM组、FG组与FM组之间的愈合情况有统计学意义(P＞0.05)，可以认为NT组与FMB、FG组与FMB组及12周时FM组与FMB组之间的愈合情况差异有统计学意义(P＜0.05)。GAG组织化学染色结果经q检验差异有显著意义(P＜0.01)。
讨 论
半月板损伤的临床治疗：由外伤、退行性病变、炎性疾患等原因所致的半月板损伤是常见疾病。其治疗方式可概括为以下几种：①损伤半月板留置加关节腔内药物注射治疗。对不需手术的患者，药物能促进损伤半月板的愈合，缩短修复时间；对已行半月板手术的患者，药物也能减轻手术所致的炎症反应，膝关节是否需要限制活动一段时间还没有统一的认识。②开放性半月板全切和部分切除术治疗。半月板切除术后也会引起膝关节运动的变化：切除内侧半月板会增加膝关节的内翻程度；切除外侧半月板，外翻增加了；载荷、运动功能的变化已被证明能干扰关节软骨、软骨下骨所处的生化环境，而这些变化如蛋白聚糖含量的减少；胶原、蛋白聚糖合成速度的变化；蛋白聚糖结构的改变；滑液成分的改变，与OA的形成有关。③半月板修复治疗：一般认为位于有血运区即红-红区、红-白区的撕裂才适合修补，采用半月板修补术有一定的指征。④关节镜下半月板部分切除术。关节镜手术具有手术创伤小，危险性小、术后无须制动能早期活动、病程短的优点。⑤同种异体半月板移植重建半月板。用半月板移植来取代缺损的半月板已在人、山羊、狗、的实验中取得成功。⑥组织工程用于半月板损伤的治疗。随着对细胞生化学、生长因子治疗、基因治疗、材料工程的研究，组织工程用于半月板损伤修复和替代治疗，结果令人鼓舞。
综上所述，半月板损伤经历了由不治疗到治疗、由完全切除到尽量保留、由开放手术到关节镜下手术、到移植、重建等治疗阶段；如何保全和建立半月板结构、形态的完整，保证其正常的生物力学功能，是治疗的关键和目的。
结论：①自体纤维蛋白胶具有取材方便、无免疫原性等优点，可作为一种理想的载体。②BMP-2可诱导骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞方向分化。③以自体纤维蛋白胶为基质材料，BMP-2可诱导MSCs转化成纤维软骨细胞用于修复半月板损伤。
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