基于PMA-qPCR方法检测兽用消毒剂对非洲猪瘟病毒的灭活效率
时间：2023-04-25 12:35:08 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
杨 悦，邵 靓，张鹏飞，陈弟诗，陈婉婷，王 印，3，*，罗 燕，3，杨泽晓，3，姚学萍，3，任梅渗，3
(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；
2.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 611130；
3.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一种猪急性和烈性传染病。强毒株可引起猪的高死亡率，达90%以上[1]。由于该病的严重危害性与病原致病机理的复杂性，且无有效疫苗进行防控，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前针对ASFV疫情，我国建立了以清洗消毒为预防手段，以隔离封锁和精准剔除为控制手段的一整套生物安全防控体系。其中，清洗消毒是防疫于未然的关键环节。但目前防控中常见消毒剂滥用、错用等问题，导致消毒效果不佳，养猪场防疫能力低下，且缺乏科学的消毒效果评估体系，阻碍了防控手段技术的更新，是疫情未得到有效控制的重要原因之一。
本研究建立了可检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的PMA-qPCR方法，又称活力PCR(viability PCR，vPCR)，该方法原理建立在叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)作用机理之上，PMA是一种叠氮类核酸染料，对核酸具有高度亲和力，能够进入病毒衣壳破损的失活病毒内部，在强光作用下，所带的光敏性叠氮基团转化为高活性的氮宾自由基[2-3]，并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳键[4-5]，致使核酸分子永久修饰，最后阻断核酸分子的扩增，消除了失活病毒核酸对检测结果的影响[6-7]；
同时，由于活性病毒具有完整的衣壳，PMA被阻隔在病毒之外，故不能阻断活性病毒核酸分子的扩增[8-11]。此外，驻留在溶液中没有与核酸分子进行交联的PMA在强光照射的同时与水分子反应生成没有活性的羟胺[12]。PMA具有结合游离核苷酸使其不能在PCR中扩增的特性[13-15]，结合qPCR，就能通过PMA-qPCR定量检测样品中完整病毒粒子的数量。PMA-qPCR方法可以用于检测细菌或病毒是否具有完整结构、病毒理化特性研究、筛选消毒剂品类与最佳作用条件、评价生物安全措施效果[16]，在ASFV的防控中具有极大的应用潜能。
目前猪场常用的消毒剂主要有酚类、醛类、醇类、酸类、碱类、卤化物类、过氧化物类和季铵盐类等，种类繁多，各类消毒剂均有其优缺点。探寻高效消毒剂，使用高效经济的手段达到预期的生物安全防控效果，是科研力量集中的方向之一。本研究拟通过建立PMA-qPCR方法对消毒剂的消毒效果进行评估，并探究消毒剂的最佳作用条件。该结果可为猪场生物安全的消毒环节提供参考，为临床生产中消毒剂的选择、作用条件提供指导。
1.1 主要材料
非洲猪瘟阳性病猪脾、肾组织由四川省动物疫病预防控制中心实验室保存，孔径0.22 μm绿色针式过滤器购自成都浩搏优科技有限公司，PMA购自Biotium公司，Pro Taq HS预混型探针法qPCR试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，通用型基因组DNA提取试剂盒购自柯菲特(香港)国际贸易有限公司。
1.2 ASFV-PMA-qPCR方法的建立
1.2.1 ASFV引物及探针合成
参照《T/CVMA 5—2018 非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法》合成引物与探针，序列见表1。
1.2.2 ASFV-qPCR标准曲线建立
提取ASFV阳性组织DNA，采取上述特异性引物PCR扩增目的基因，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，克隆至pMD19-T载体。利用NanoDrop 2000核酸蛋白分析仪测定重组质粒标准品浓度，并计算其拷贝数。将重组质粒标准品稀释至104～1010拷贝·μL-1并作为模板，进行qPCR扩增。以循环数为纵坐标、模板稀释度为横坐标，建立qPCR标准曲线。
表1 引物与TaqMan探针序列信息
1.2.3 PMA-qPCR方法建立
将ASFV阳性组织研磨成匀浆，用无菌0.22 μm滤头过滤制成病毒液，分装保存于-80 ℃备用。制备10 mm×10 mm的无菌方形滤纸片若干作为吸附介质，平铺于无菌平皿内，逐片滴加20 μL病毒液，以作含毒载片。置室温下自然阴干后备用。
按表2设置实验分组，将第1、3组样品高压蒸汽灭菌，第2、4组样品常温放置，每组重复处理3次，每个重复3张含毒载片。处理后加入500 μL无菌双蒸水，振荡离心。取200 μL各处理组样本，第1、2组分别加20 μL(0.1 mg·mL-1)PMA染液，第3、4组分别加20 μL无菌双蒸水，混匀后置于暗室孵育20 min。将所有管置于冰盒上，在500 W卤素灯下照射20 min，期间每隔5 min翻转离心管，使其均匀曝光。使用通用型基因组DNA提取试剂盒提取上述各处理组所得含毒载片悬液中的病毒DNA，具体操作步骤参考试剂盒说明书，提取所得DNA分装于-80 ℃保存备用。使用1.2.1节中引物与探针，参照《T/CVMA5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法》进行qPCR检测，每组样本设置3个技术重复。反应参数设置如下：95 ℃ 3 min；
95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环；
在每次循环的60 ℃退火延伸时收集荧光信号。试验结束后，根据收集的Ct值判定结果，并计算拷贝数。
表2 PMA-qPCR分组
1.3 消毒剂作用效果的评估
1.3.1 消毒剂作用
按生产常用浓度配制消毒剂。为符合生产操作，无特殊说明者，一律使用硬水配制，即配即用。消毒液的稀释度与种类为0.5%过硫酸氢钾复合物、1%二氯异氰尿酸钠、2.5%二氧化氯、0.2%复合碘、0.5%辛硫磷、0.2%复合戊二醛季铵盐溶液、1%复合有机酸、0.5%溴化二甲基二癸基羟胺、0.25%戊二醛-癸甲溴胺溶液。
试验组：用200 μL配置好的各组消毒剂充分浸泡含毒载片，静置30 min后，取出含毒载片于含500 μL无菌蒸馏水的离心管中振荡混匀，8 000×g离心2 min，取200 μL上清液备用。每组消毒剂做3个重复，每个重复3张含毒载片。
阳性对照组：含毒载片经高压蒸汽灭菌处理，用无菌双蒸水代替消毒剂溶液，作用至30 min，加入500 μL无菌双蒸水，振荡混匀，8 000×g离心2 min，上清液作为阳性对照组样本备用。
阴性对照组：含毒载片经常温放置处理，用无菌双蒸水代替消毒剂溶液，作用至30 min，加入500 μL无菌双蒸水，振荡混匀，8 000×g离心2 min，上清液作为阴性对照组样本。所得结果代表病毒液原有拷贝数，以其作为计算灭活对数的初始拷贝数。
1.3.2 PMA-qPCR
取200 μL各处理组样本，分别加入20 μL PMA染液(0.1 mg·mL-1)，置于暗室孵育20 min。将所有管置于冰上，在500 W卤素灯下照射20 min后，使用通用型基因组DNA提取试剂盒提取上述各处理组样品的病毒DNA，用于qPCR检测。试验结束后，根据收集的Ct值判定结果，并计算拷贝数。
1.4 消毒剂最佳作用条件的优化
在上述消毒剂中，选取消毒效果最好的一种消毒剂，按照1.3节方法依次进行消毒剂的工作浓度(2%～0.2%稀释)、作用时间(1～30 min)的优化，筛选出消毒剂的最适作用浓度和最佳作用时间。
图1 ASFV-qPCR标准曲线Fig.1 Standard curve of ASFV-qPCR
2.1 ASFV-PMA-qPCR方法的建立
2.1.1 ASFV-qPCR标准曲线
将ASFV重组质粒标准品分别稀释至104～1010拷贝·μL-1并作为模板，进行qPCR扩增。以循环数为纵坐标、模板稀释度为横坐标，建立qPCR的标准曲线。标准曲线公式为y=-3.084x+45.770，E=111.0%，R2=0.995，x代表模板的起始拷贝浓度(copies·μL-1)的对数，y代表样品扩增的Ct值。
2.1.2 PMA-qPCR方法结果
由4组实验结果(表3、图2)可见，第1组(高压蒸汽灭菌、添加PMA)qPCR没有扩增曲线，第3组(高压蒸汽灭菌、不添加PMA)有典型的S型扩增曲线，证明通过PMA处理阻止了失活病毒PCR扩增。第2组(常温处理、添加PMA)和第4组(常温处理、不添加PMA)都有典型的S型扩增曲线，证明PMA处理不会阻止完整病毒PCR扩增。由此可见，通过PMA-qPCR方法可以检测病毒是否具有完整结构。
表3 PMA-qPCR各实验组Ct值
1～4，PMA-qPCR实验第1～4组扩增曲线。1-4， Amplification curves for groups 1-4 of the PMA-qPCR experiment.图2 PMA-qPCR各实验组扩增曲线Fig.2 PMA-qPCR amplification curve of each experimental group
2.2 消毒剂作用效果的评估
用9种不同消毒剂处理后，提取病毒DNA进行PMA-qPCR检测，每组重复处理3次。收集各组Ct值，根据标准曲线公式计算病毒拷贝数，采用方差检验法(t检验)对各组拷贝数进行统计分析。结果显示，各组P值均小于0.000 1(图3)。
****表示达到0.000 1 显著水平。1～9，1～9号消毒剂，具体见表4。**** meant significant differences at the levels of 0.000 1.1-9， No. 1-9 disinfectants, shown in Table 4.图3 消毒剂作用后剩余病毒拷贝数Fig.3 Copy number of virus left after disinfectants
对拷贝数进行对数转换处理，用病毒灭活率公式计算各组消毒剂对ASFV的灭活率，病毒灭活率(%)=[1-10(阴性组病毒拷贝数-实验组病毒拷贝数)]×100。结果(表4)表明，ASFV对不同种类的消毒剂有不同的敏感性，对过硫酸氢钾复合物的敏感性最高；
寄生虫药物(辛硫磷)也能灭活81.75%的ASFV。
表4 不同消毒剂对ASFV的灭活率
2.3 消毒剂最佳作用条件的优化
选取消毒效果最好的过硫酸氢钾复合物消毒剂，稀释为2、2.5、3、5、10、20 g·L-1并与含毒载片反应30 min，提取病毒DNA进行PMA-qPCR检测，每组重复处理3组，计算灭活率。2～20 g·L-1过硫酸氢钾复合物溶液能不同程度地灭活ASFV，质量浓度大于5 g·L-1的过硫酸氢钾复合物溶液对ASFV的灭活率能达到99%以上，质量浓度小于5 g·L-1的过硫酸氢钾复合物溶液对ASFV的灭活率随质量浓度减小而逐渐下降(图4-A)，所以5 g·L-1是在能达到良好消毒效果要求下最经济的用量。
将过硫酸氢钾复合物消毒剂稀释到5 g·L-1，按1、5、10、15、20、25、30 min时间梯度处理含毒载片，提取病毒DNA进行PMA-qPCR检测，每组重复处理3组，计算灭活率。结果(图4-B)表明，病毒灭活率随作用时间的延长而升高，过硫酸氢钾复合物溶液作用1 min即可灭活97.19%的ASFV，作用20 min灭活率提升到99%。实际生产中，应尽量延长作用时间。
A，不同质量浓度过硫酸氢钾复合物对ASFV的灭活率；
B，过硫酸氢钾复合物不同作用时间对ASFV的灭活率。A， Inactivation rate of potassium persulfate complex at different concentrations on ASFV；
B， Inactivation rate of potassium persulfate complex on ASFV at different action times.图4 过硫酸氢钾复合物优化结果Fig.4 Optimization results of potassium hydrogen persulfate complex
本研究建立了PMA-qPCR方法，通过此方法测定了常用消毒剂对ASFV的灭活效果，筛选出了效果最好的消毒剂，优化了消毒剂的最佳使用质量浓度、作用时间。王巍等[17]总结阐述了养殖场常用消毒剂灭活ASFV的原理，发现消毒剂均能直接破坏病毒衣壳或阻断膜上生化反应，最终使病毒失去结构完整性，所以使用PMA-qPCR方法能够更加方便快捷地得出常用消毒剂对ASFV的灭活效率。以往若要确定病毒是否具有感染性，需进行细胞实验或动物实验，如血细胞吸附试验(hemadsorption，HAD)，该方法原理是ASFV的EP402R基因编码的外囊膜蛋白CD2v能够诱导红细胞吸附现象，但实验所需的猪肺泡巨噬细胞价格昂贵，且ASFV细胞感染试验需要在Ⅲ级生物安全实验室(BSL-3)内进行，强阳性样品在接种细胞后24 h内可观察到红细胞吸附现象[17-18]。细胞或动物实验操作繁琐，容易被受体细胞或受体动物个体差异影响。PMA-qPCR方法能够简捷快速地检测ASFV的活性，可用于鉴别包膜结构完整的ASFV。相较于细胞或动物实验，PMA-qPCR方法的优点在于避免了细胞培养、动物饲养，更加便捷、经济、准确，且可以定量。PMA-qPCR方法用于病原微生物的检测，具有广阔的应用前景与实际价值。
本研究结果显示，目前使用的消毒剂种类中，过氧化物类和卤素类的消毒效果较好，灭活率能达到95%以上，醛类和季铵盐类次之。纵观所测试品类的消毒剂，过硫酸氢钾复合物消毒效果最好。该结果可为过硫酸氢钾复合物用于养殖场内场地、物品消毒提供参考。消毒效果随消毒剂作用时间和作用质量浓度变化而变化，消毒剂质量浓度越高、作用时间越长，消毒效果越好，但实际生产中还要考虑使用成本，所以养殖场应选用最低的稀释比例达到最高的消毒效果，并尽量延长作用时间。
在规模化养殖生产中，正确使用化学消毒剂至关重要，而许多养殖户对常用消毒剂了解不深，经常错用、滥用，从而影响了畜牧业生产的健康发展。因此，如何恰当地选择消毒剂并合理利用对有效抵御病毒感染十分关键。提高对生物安全方面的重视程度，建立完善的生物安全防控体系是应对非洲猪瘟问题的必经之路，所以生猪养殖业的相关从业人员要加强对生物安全防控的重视，使养猪场逐渐规模化，从而为建立科学、完善的生物安全防控体系提供条件。
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