铁死亡在脑卒中的作用及针刺干预机制

邓小嫚,彭拥军

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

脑卒中(Stroke)是我国目前发病率、致残率、致死率与复发率均较高的疾病之一，也是我国目前伤残调整寿命年的主要原因[1]。脑卒中是由于多种原因导致脑血管突然发生破裂或堵塞，表现为脑组织损害及脑功能障碍的急性脑血管疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种类型。脑卒中患者常易罹患各种并发症，不仅危害患者身心健康，还极大增加家庭及社会经济负担[2]。溶栓治疗(Thrombolytic therapy)是目前治疗脑卒中公认的最有效的方法，但是有严格的时间要求，而且目前针对脑卒中损伤的药物治疗效果并不理想。因此，探讨脑卒中发生机制和寻找减轻脑卒中损伤的潜在有效治疗靶点，具有十分重要的意义。

脑卒中的损伤机制目前认为与坏死、凋亡、自噬及焦亡等神经细胞死亡形式密切相关。近期研究发现，铁死亡(Ferroptosis)作为一种新兴的细胞死亡形式正在成为脑卒中以及其他急性脑损伤类疾病的重要发生机制。而且，有研究证实铁抑制剂或铁螯合剂可明显减轻神经功能损伤。铁死亡是由Stockwell团队于2012年首次提出[3]，以铁超载、铁依赖性脂质过氧化产物蓄积、线粒体体积减小及线粒体膜厚度增加为主要特征。目前认为，铁死亡的主要机制是由于二价铁(Fe2+)或酯氧合酶(Lipoxygenases，LOXs)的作用，催化了细胞膜上高表达的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)发生脂质过氧化，从而诱导细胞发生死亡[4]。

中医学常采用针刺治疗脑卒中，疗效显著[5]。针刺治疗脑卒中的干预机制可能与抑制炎性反应、减轻氧化应激、调节脑代谢、抑制凋亡、激活自噬、促进神经再生及血管新生等密切相关[6]。近年来，由于铁死亡研究的不断深入，学者们发现针刺治疗脑卒中与铁死亡亦关系密切。关于针刺抑制脑卒中神经细胞铁死亡的干预机制仍在研究中，目前尚不明确。本研究旨在探讨铁死亡在脑卒中的发生发展过程中发挥的作用及针刺的干预机制，以期为临床研究中针刺靶向铁死亡减轻脑卒中后神经损伤提供强有力的科学证据。

1.1 氧化还原失衡

铁死亡最突出特征为脂质活性氧(Reactive oxygen species，ROS) 过载，与细胞膜上的PUFA发生过氧化反应，造成细胞膜破坏，导致细胞死亡。细胞对铁死亡的敏感性主要是由谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4，GPX4)调节。GPX4是细胞内唯一一个用于脂质过氧化物还原的硒代半胱氨酸酶，它在还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的作用下将脂质过氧化的过氧键转为羟基，使其失去过氧化物的活性。GSH在细胞内促进磷脂氢过氧化物(Phospholipid hydrope-roxides，PLOOHs)还原为相应的醇，从而提高细胞抗氧化能力，减少脂质活性氧的堆积，抑制铁死亡的发生。胱氨酸-谷氨酸逆向转运体(the cystine /glutamate reverse transporters，System Xc-)是细胞内重要的抗氧化体系，可以摄取胱氨酸，排出谷氨酸，促进GSH的合成，维持GPX4活性。研究证实[7]，小分子erastin可以通过抑制System Xc-对胱氨酸的转运，从而促进GSH耗竭，使GPX4失活，进而诱导铁死亡，而Ras选择性致死小分子3(RAS-selective lethal small molecule 3，RSL3)则通过抑制GPX4的活性直接诱导细胞发生铁死亡[8]。间接抑制System Xc-或直接抑制GPX4活性均可引起细胞铁死亡的发生。可以推测，System Xc-GSH-GPX4轴氧化还原失衡是铁死亡的重要机制之一[4]。

此外，研究发现[9]，LOXs可以直接氧化生物膜的PUFA，提示LOXs可能介导铁死亡的诱导过程。LOXs不依赖于GPX4的活性，主要与半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡相关，但目前尚无明确遗传学证据证明LOXs参与铁死亡过程。除了有争议的LOXs在铁死亡中的作用外，最新研究报道[10]，细胞色素P450氧化还原酶(POR)参与启动脂质过氧化。NADPH作为电子供体从POR接受电子后，下游电子受体(细胞色素P450和CYB5A)被还原，进而通过从PUFAs中提取亚甲基氢或还原铁触发脂质过氧化反应。目前推测，LOXs与POR氧化还原失衡也可能参与了铁死亡的发生。

1.2 铁代谢障碍

铁代谢障碍引起细胞内游离铁增多是铁死亡的特征之一。铁分为Fe2+与Fe3+两种氧化态，在铁死亡的过程中扮演着十分重要的角色。生理状态下，铁池能够保持动态平衡。而病理状态下，Fe2+集聚在细胞内，发生哈伯-韦斯反应与芬顿反应，产生大量ROS，与细胞膜上的PUFA发生过氧化反应，导致细胞膜结构破坏，引起细胞铁死亡[11]。其次，Fe2+能够作为多种磷脂过氧化代谢酶的辅因子，参与了代谢酶发挥催化活性的过程[12]。此外，许多细胞过程通过改变细胞内的不稳定铁含量而改变细胞对铁死亡的敏感性。转铁蛋白及其受体通过将铁导入细胞而共同促进铁死亡。相反，促进细胞内铁排出已被证明使细胞对铁死亡具有更强的抵抗力，铁调节蛋白IRP1与IRP2参与了与细胞内铁储存和释放相关基因的转录后调节。因此，铁储存、释放及转运等代谢障碍是铁死亡的重要机制之一[13]。

1.3 GPX4非依赖性铁死亡

目前认为，GPX4非依赖性铁死亡主要与FSP1-CoQ-NAD(P)H轴、GCH1-BH4-DHFR轴及鲨烯积累有关[4]。Bersuker和Doll等[14-15]认为FSP1-CoQ-NAD(P)H轴与GPX4-GSH轴协同参与了铁死亡的发生。铁死亡抑制蛋白1(Ferroptosis suppressor protein-1，FSP1)是一种类似于脂质过氧化物捕获剂的铁死亡抑制剂，其不依赖于GPX4的活性而独立起作用。FSP1具有NADH：泛醌氧化还原酶活性，FSP1通过还原泛醌(CoQ10)/泛醌的不完全氧化产物半氢醌产生泛醇，或者间接促进氧化型α-生育酚自由基(天然抗氧化剂)再生，减少脂质自由基，终止脂质自氧化反应。最近研究报道[16]，GTP环水解酶-1(GCH1)可通过其代谢产物四氢生物蝶呤(BH4)和二氢生物蝶呤(BH2)预防铁死亡。BH4被证明可能通过双重机制，即既作为直接RTA(需要通过二氢叶酸还原酶DHFR再生)，又参与CoQ10合成，保护含有两个PUFA尾的磷脂免受氧化降解。GCH1-BH4-DHFR轴可能参与铁死亡的发生，但仍有待阐明。胆固醇途径中的一种代谢物鲨烯积累通过内在机制保护自身免受有害的脂质过氧化，在固醇缺陷型淋巴癌细胞系和原发肿瘤中具有抗铁死亡活性[17]，但尚未证实这是癌症亚型特异性效应还是一种普遍的保护机制。

1.4 信号通路异常

1.4.1 GPX4-FSP1信号通路 越来越多的证据表明，GPX4的表达受到严格调控，如增加细胞内硒含量可以协同激活转录因子TFAP2c和Sp1来促进神经元中GPX4的表达。FSP1是重要的铁死亡抑制因子，最初是作为p53应答基因被发现。因此，FSP1还被称为p53应答基因3(p53-responsive gene 3，PRG3)。FSP1是转录因子NRF2、CRBP和PPARα的靶基因，同时作用于还原性和氧化性底物。除了转录调控，FSP1的氧化还原酶活性是如何被调控尚不明确。但目前已知的是[18]，GPX4和FSP1在某种程度上与甲羟戊酸途径相交集，GPX4-FSP1信号通路异常可能参与铁死亡的过程。

1.4.2 E-cadherin-NF2-Hippo-YAP信号通路 E-cadherin-NF2-Hippo-YAP信号通路在调控铁死亡方面发挥作用。细胞密度对上皮细胞铁死亡的调控作用是由上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)介导的细胞间接触所介导，这种细胞间作用能通过NF2肿瘤抑制蛋白激活细胞内Hippo信号通路，从而抑制肿瘤蛋白YAP的核转位和转录活性。YAP靶向多个铁死亡调控因子[19]，包括ACSL4、转铁蛋白受体TfR1等。因此，抑制Hippo通路和激活YAP均可以促进铁死亡。

1.4.3 AMPK信号通路 有研究发现[20]，在肿瘤细胞中使用AMPK激活剂，可以调节细胞脂质合成代谢，进而减轻铁死亡的发生。葡萄糖饥饿可以抑制细胞铁死亡，这种保护作用依赖于能量感应激酶AMPK的活性。当葡萄糖缺乏时，AMPK被激活，启动了一种能量应激保护程序，以对抗铁死亡，这涉及到PUFAs的生物合成受损，而PUFAs是脂质过氧化诱导的铁死亡所必须。这种保护机制可能是保护机体免受能量耗竭导致的器官损伤的第一道防线。

2.1 铁死亡参与脑卒中的发生

缺血性脑卒中由于缺血、缺氧但尚未发生器质性坏死，故其脑组织仍具有可逆性，在恢复血液供应后病情恶化，即脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[21]。研究发现[22]，CIRI发生后，脂质过氧化明显增多，且细胞内铁含量出现升高，与铁依赖性非凋亡形式的铁死亡表现十分符合。另外，铁螯合剂或抗氧化剂可以预防CIRI。CIRI患者的T2加权磁共振图像也证实了由于铁沉积而导致基底节、丘脑及白质区出现低强度信号[23]。此外，在CIRI的实验动物模型中可以看到脑部患侧区域出现铁蓄积[23]。目前，铁死亡作为一种新型的死亡形式已经越来越被重视，并且有望成为逆转缺血性脑卒中神经细胞损伤的重要环节。

出血性脑卒中可使神经细胞发生铁死亡。当脑出血发生后，血液进入大脑间隙，红细胞大量溶解，血红蛋白释放，并被裂解为含铁血红素和珠蛋白，在HO-1的氧化作用下，含铁血红素被分解为游离铁、CO和胆绿素，过量的铁沉积在血肿周围的脑间质中，在胞吞小泡的作用下进入细胞质，并以铁蛋白的形式储存，引起胞内铁蓄积，继而发生芬顿反应产生大量ROS，与细胞膜上的PUFA发生过氧化反应，从而促进细胞铁死亡。Zille等[24]研究发现脑出血后神经细胞出现铁死亡的药理学和分子学特征。Li等[25]发现血肿周围神经细胞发生了铁死亡，并且发现铁死亡的神经细胞形态学特征。

2.2 铁死亡抑制剂或铁螯合剂改善脑卒中

目前，已经发现多种物质可以抑制铁死亡，如甲磺酸去铁胺、维生素E、谷胱甘肽、Trolox、Ferrostatin-1、Liproxstatin-1、部分中药及其活性成分等。Tuo等[26]在小鼠脑缺血损伤中检测到显著的铁死亡发生，当再灌注时使用铁死亡抑制剂liproxstatin-1或ferrostatin-1可显著减少梗死面积，从而改善脑缺血再灌注损伤。铁螯合剂可以通过抑制自由基的生成，提高酶活性，促进新生羊缺血再灌注损伤模型神经功能恢复，改善缺血再灌注脑损伤，提高生存率[27]。方氏等[28]认为铁螯合剂改善脑缺血再灌注损伤可能与其结合体内铁离子、促进铁离子排泄和减少铁离子在脑组织内沉积有关。GUAN等[29]发现香芹酚可通过有效降低活性氧表达，减少铁沉积和提高GPX4含量，抑制缺血再灌注损伤后海马神经元的损害，并且逆转神经功能的缺陷。此外，研究发现[30]，抑制铁蓄积及活性氧的产生，可以降低早期脑损伤、预防继发性脑损伤，进而改善脑出血患者的预后情况。铁死亡在脑卒中的发生发展中发挥着关键作用，而铁死亡抑制剂或铁螯合剂等有望通过调节铁代谢障碍，改善铁死亡诱导的脑损伤。然而，目前针对铁死亡与脑卒中的研究仍局限于细胞实验、动物实验等，铁死亡与人类脑血管疾病之间的确切关系仍有待深究。

3.1 减轻氧化应激

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，是由自由基在体内产生的一种负面作用。氧化应激是脑卒中神经元损伤的重要原因之一。因此，清除自由基、提高脑细胞的抗氧化能力可保护大脑减少氧化应激损伤。研究表明[31]，针刺脑缺血再灌注损伤模型大鼠的“百会”“四神聪”等穴位可显著增加脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等重要抗氧化酶的含量，有助于提高抗氧化能力，起到脑保护作用。针刺也可以降低脑出血组织中脂质过氧化产物LPO含量[32]。朱氏等[33]发现电针预处理可以上调缺血半暗带区域兴奋性谷氨酸转运体2的表达，诱导脑缺血耐受。王氏等[34]发现针刺大鼠“百会穴”“足三里穴”，可以上调血清中SOD表达，降低MDA含量，拮抗氧化应激反应，从而达到修复与保护脑组织的目的。研究证实[35]，脑出血大鼠脑组织内GPX4含量显著降低，而针刺可以上调大鼠脑组织内GPX4表达，提高抗氧化能力，抑制铁死亡，进而改善脑出血大鼠早期损伤。李氏等[36]通过实验研究发现，针刺“百会”透“曲鬓”可明显降低脂质过氧化物MDA含量，推测针刺疗法可能通过抑制脑出血大鼠神经细胞铁死亡促进出血大鼠神经功能修复。

3.2 改善线粒体损伤

铁死亡的发生过程中一定会伴有不同程度的线粒体形态改变和功能失调，如出现线粒体积缩小，线粒体嵴减少，线粒体外膜破裂等[37]。而且，铁死亡的发生与线粒体损伤程度、能量供应及新陈代谢的损害严重程度密切相关。缺血性脑卒中发生后，缺血再灌注会严重阻碍ATP的产生，然而大脑需要持续产生高水平的ATP才可以维持代谢活性和神经元稳态来对抗氧化应激[38]。因此，在缺血状态下大脑非常容易累积线粒体代谢副产物[39]。GAO等[40]在研究中发现抑制线粒体三羧酸循环及电子传递链能够减少线粒体膜电位过极化，降低脂质过氧化物积累，使细胞免于铁死亡。研究证实[41]，针刺能促进MCAO大鼠大脑尾状壳、皮质运动区以及体感皮层等区域中的脑葡萄糖代谢，提高调节细胞代谢和能量稳态关键分子腺苷一磷酸激活的丝氨酸蛋白激酶的磷酸化程度，从而促进神经活动和运动功能的恢复。许多研究表明[42-43]，针刺可以保护海马线粒体超微结构的完整性。李氏等[36]通过实验研究发现，针刺“百会”透“曲鬓”在一定程度上改善了线粒体形态损伤，并推测针刺通过改善线粒体损伤进而抑制神经细胞铁死亡，促进脑出血大鼠神经功能修复。通过对线粒体的具体作用机制进一步研究，发现电针“百会”与“足三里”通过Pink1/Parkin介导的线粒体自噬清除，可以明显增加线粒体膜电位和ATP水平，减轻硝基/氧化应激诱导的线粒体功能损伤，减少受损线粒体的堆积，从而保护脑细胞免受脑缺血/再灌注损伤[44]。

3.3 调节铁代谢

脑出血发生过程中，铁总浓度会增加，导致神经元细胞产生严重损伤。血肿吸收过程中释放的血红素和游离铁可能是脑出血神经细胞死亡的重要诱发因素之一。研究发现[45]，大鼠发生脑出血后，脑脊液内的铁含量会增加，并且需要至少28 d多余的铁才能被清除。研究表明[46]，在脑出血大鼠的脑内注射铁离子可以直接引起脑水肿，而铁离子螯合剂可以减轻水肿，说明铁离子在脑出血水肿的形成中具有十分重要的作用。毕氏通过研究发现[47]，电针治疗通过对microRNA的调控影响ASCL4、Ireb2、PTGS2、FPN和GPX4基因的表达改善脑低灌注导致的脑铁沉积。徐氏等[48]发现脑出血发生后，音乐电针可降低脑内铁离子含量，降低脑组织水肿，减少脑神经元细胞的凋亡。说明音乐电针对急性脑出血大鼠脑内灶周的铁离子具有良性调节作用，通过抑制脑出血后早期血肿周围部位神经元细胞的凋亡，减轻脑水肿。

3.4 调控信号通路

针刺可通过调节脑卒中发生过程中相关信号通路促进神经元再生和修复，从而改善神经病变。头针可以有效改善脑出血后神经功能已经得到广泛认可[49]。研究发现，针刺“百会”透“曲鬓”可以减轻脑出血后继发性病理损伤，其中包括抑制神经细胞死亡信号传导[50]。头针治疗脑出血可以减轻MDA和铁螯合，减少线粒体形态改变，抑制神经元铁死亡，这些效应的通路可能与增强p62、Nrf2、GPX4及FTH1的表达，抑制Keap1的表达密切相关。而且应用头针可减少脑出血后神经行为异常，与去甲氧胺治疗的效果无明显差异。目前推测，头针可能通过调控抗氧化通路p62-Keap1-Nrf2，引起FTH1和GPX4的表达增加，从而改善脑出血后的神经恢复[51]。此外，实验表明[52]，夹脊电针可以激活Nrf2的活性，通过Nrf2/ARE通路增加GSH含量，发挥抗氧化作用。在铁死亡中GSH正是System Xc-GSH-GPX4通路中关键的抗氧化物质，可以上调GPX4的活性，从而抑制铁死亡。因此，夹脊电针促进神经恢复与铁死亡System Xc-GSH-GPX4通路密切相关。铁死亡的发生过程还与E-cadherin-NF2-Hippo-YAP信号通路、AMPK信号通路等有关，目前针刺疗法与其他信号通路之间的联系尚不明确，未来还有待进一步研究。

综上所述，铁死亡在脑卒中的发生发展中扮演着重要角色，针刺在其中的干预机制已经取得一定的进展，与减轻氧化应激、改善线粒体损伤、调节铁代谢和调控信号通路等密切相关。但针刺对于脑卒中铁死亡的干预机制错综复杂，未来仍有待进一步研究。针刺作为一种绿色疗法，具有操作简单、经济成本低和场所要求低等优势，值得广泛推广。在今后的研究中，还需关注更多的问题。其一，脑卒中发生时铁死亡与其他细胞死亡方式可能是相互影响的，存在何种交互通路，未来还需进一步研究各机制之间的联系，特别是分子生物学、蛋白质组学及基因水平，进一步完善针刺干预机制;其二，在针刺治疗方面，目前尚无明确的选穴，未来应该进一步探索选穴规律，完善中医基础理论;其三，目前关于脑卒中铁死亡的研究大多以动物实验为主，鲜有临床试验的开展，缺乏有力数据和样本支撑，未来应扩展到临床试验的研究，以期为脑卒中的临床治疗及基础研究提供新思路。

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