非洲猪瘟血清学诊断技术研究进展
时间：2023-04-16 18:45:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
杨钦翔，邹兴启，赵启祖
(中国兽医药品监察所 国家/WOAH猪瘟参考实验室，北京 100081)
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种猪急性、热性、广泛出血传染病，致死率高达100%[1]。该病现阶段仍然缺乏有效的疫苗，主要通过监测、扑杀及加强生物安全管理等综合措施来防控。诊断是防控该病的第一步，血清学诊断作为一种特异性、敏感性较强的诊断方法，在临床使用上操作方便、成本低，发挥着不可取代的作用，常用方法如酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、免疫过氧化物酶试验(immunoperoxidase test,IPT)、免疫印迹试验(immunobiotting test,IBT)以及免疫层析法(immunochromatographic assay, ICA)。本文对血清学诊断技术进行总结，为更好地了解ASFV结构，改进和研究新的血清学诊断方法提供思路。
ASF自1921年被发现以来，一直受各国养猪业的高度重视，世界动物卫生组织(WOAH)将ASF列为法定报告动物疫病，同时也是我国一类动物疫病。1921年ASF首次在肯尼亚爆发，开始呈现地方性流行。1957年，ASF传到了葡萄牙，至此ASF在欧洲地区传播，经30多年才得以消灭。2007年，ASF再次从格鲁吉亚向周边扩散蔓延，随后逐年向外延伸，向西传至欧洲腹地国家，向东至远东地区，对周边国家形成了严重的威胁[2]。
2018年8月，在沈阳发现中国首例ASF病例，随后在中国各省市迅速蔓延。2018-2019年ASF主要分布在我国东北及中东部地区。得益于有效的防控措施，ASF疫情总体可控，呈现发散、减弱趋势。2020年共报告19起，扑杀生猪1.35万头，2021年共报告14起，扑杀0.36万头，疫情形式总体逐渐平稳[3]。
我国自2018年首次报道ASF以来，全国均发生并流行ASF，造成了大量猪只死亡和重大经济损失。初期，ASF急性发病，病程短，死亡率高，往往未产生抗体猪就死亡，主要采用荧光PCR等快速核酸检测技术进行病原学诊断。2020年我国发现了低致死率ASFV基因Ⅱ型变异株以及基因Ⅰ型毒株[4-5]。国内ASF疫情流行发生重大变化，出现慢性隐性感染，传染隐蔽性加强，防控难度加大。猪通常在感染后7～10天内产生针对ASFV的抗体，并持续很长一段时间。因此，对亚急性和隐性的ASF诊断可以进行特异性血清学检测。
了解ASFV粒子的结构以及蛋白质的组成对于血清诊断有着免疫学意义，ASFV是一个大型的双链DNA病毒，基因组全长为170～190 kb，可以分为24个基因型，根据基因型的不同有151～167个开放阅读框(ORF)，编码50多结构蛋白和100多种非结构蛋白[6-7]。ASFV粒子呈现二十面体形态，有囊膜[8]。病毒粒子由内到外主要由五个部分组成，分别是第一层病毒基因组(Genome)DNA的拟核、第二层内核芯壳(Core shell)、第三层内膜(Inner envelope)、第四层衣壳(Capsid)和第五层囊膜(External envelope)[9]。结构图如图1所示。
图1 ASFV 颗粒图示和每一层中的蛋白质[10]Fig 1 Illustration of ASFV particle and examples of proteins in each layer[10]
对于血清学诊断，寻找具有良好反应原性的抗原是构建诊断方法的关键。Alejo等人使用蛋白质组学技术，质谱和免疫电子显微镜的方法建立具有Vero适应的ASFV的蛋白质抗原图谱，总共鉴定68种病毒蛋白和44种未被识别的蛋白[11]。由B646L编码p72蛋白是ASFV构成二十面体衣壳的主要结构蛋白，是ASFV晚期表达蛋白，分子质量在73.2 ku。p72是第一批被确定为在自然感染后诱导抗体的病毒蛋白之一[12]，具有很强的反应原性和免疫原性，也是病毒感染后血清中存在的主要抗体[13]。但部分ASFV毒株的p72基因在C末端不保守，所以以p72抗原开发血清学诊断方法时应该注意C末端的使用[14]。
p54蛋白是ASFV早期表达蛋白，编码基因为E183L，位于病毒的内囊膜，其免疫原性好、结构保守。实验中将重组蛋白克隆到pGEX中以大肠杆菌表达，用感染血清进行测试，重组p54的IgG和IgM抗体具有良好的反应性[15]。由于p54蛋白在感染后早期表达，并且血清中p54抗体可以长期存在，是血清学检测的重要靶点。p54在不同地区毒株的氨基酸具有一定的差异，但也有研究表明p54作为血清学检测靶点容易造成假阴性[16]。
p30蛋白也被命名为p32蛋白，编码基因为CP204L，在感染后早期表达，可以诱导中和抗体的产生,并且和p54一样在整个感染过程中都能被明显的检测[17]。ASF诊断国家标准国标GB/T18648-2020《非洲猪瘟诊断技术》推荐使用p30蛋白作为间接ELISA的检测抗原[18]。
CD2v蛋白是由EP402R基因编码，存在于病毒的囊膜上，与病毒毒力有关，也是病毒红细胞吸附现象的关键蛋白质[19]，同时CD2v也介导ASFV血吸附的血清学特异性反应[20]。早期研究报道CD2v免疫原性较弱，但近期发现CD2v蛋白可以表现出很好的免疫原性[21]。所以CD2v也是ASF潜在的诊断靶点。
由于分子生物学的发展，近年来大家都以大肠杆菌表达系统表达重组抗原作为原材料进行血清学诊断试验的开发，国外有使用病毒感染细胞直接包被抗原。对比重组蛋白来说，避开了操作ASFV活毒的风险，并且可以做到标准化，在不同实验室获取结果的一致性。其中Reis等人使用原核表达系统表达了血清学的12种目标蛋白(p54、K205R、A104、B602L、p72、p30、CP312R、NP419L、F334L、K196R、p10、C44L)，用ASFV分离株感染后的猪血清对重组蛋白进行酶联吸附反应，在感染后第7天E183L/p54、K205R、A104R、CP204L/p30抗体水平升高，在感染后第14天敏感性达到100%；
B602L、B646L/p72、CP312R、NP419L、F334L在感染后14天血清学反应升高，在第21天敏感性达到100%，并且抗体可以存在很长时间；
其余蛋白K196R/胸苷激酶、K78R/p10和C44L在感染后未见明显的血清学反应[15]。常见诊断标靶见表1。ASFV蛋白极性极强，对表达蛋白不做适宜的修饰很难表达成功，但修饰后表达蛋白可能与ASF阳性血清反应性变差，这也是ASFV重组蛋白作为诊断抗原的难点所在。
表1 ASFV常见诊断标靶Tab 1 Common diagnostic targets of African swine fever virus
感染ASFV后，急性发作机体未产生抗体就死亡，但随着病毒变异，亚急性或慢性感染的出现，病毒感染诱导体液反应，血液出现可检测到的抗体水平。以下介绍几种常用的血清学检测方法。
4.1 ELISA ELISA反应是将已知的抗原或抗体结合在酶标板上，利用抗原抗体结合，通过酶标抗体进行标记，最后通过显色物显色，可用酶标仪或肉眼直接观察，其显色深浅与酶标抗体的含量成正比。ELISA一般分为间接ELISA，竞争ELISA和夹心ELISA。在特异性上夹心ELISA最高，而在敏感性上间接ELISA最高，但容易出现非特异性结合。在控制敏感性和特异性一直是建立ELISA检测方法中重要的一环。我国农业农村部于2021年公布ASFV抗体检测试剂盒名单，一共有26家企业的33个产品通过比对评价，其中间接ELISA试剂盒17个，阻断ELSIA试剂盒12个，夹心ELSIA试剂盒4个。这些试剂盒多用p72、p30、p54的重组蛋白作为诊断靶标。其中个别企业以病毒MGFs和CD2v为诊断靶标建立ELSIA抗体检测试剂盒[22]。
国外生产的ID-VET ELISA抗体检测试剂盒是基于p72建立的[23]，同时INGENASA公司也基于p30、p54、p72多肽生产间接ELISA试剂盒[24]。INgezim PPA COMPAC ELISA试剂盒同样以p72蛋白为包被物建立血清学检测方法[25]。E. Nieto通过p30与p72蛋白建立间接ELISA检测方法。
4.2 IFA与IPT 对于ASF阳性或者可疑确诊的样品，可进行IFA检测。IFA与IPT试验是基于对ASF特异性抗体进行检测，这些抗体结合了被ASFV感染后固定的细胞，抗原抗体反应后对标记的荧光素蛋白或者过氧化物酶进行检测，IFA试验阳性样本会在感染细胞中出现特异性的荧光，IPT试验则是观察细胞的特异性染色，IPT区别于IFA试验是不需要荧光显微镜即可进行。IFA和IPT的特异性高于ELISA 检测方法，常作为抗体检测的金标准方法用于新建抗体检测方法的验证。此实验需要高级生物安全实验室操作病毒以及荧光显微镜，很难实现高通量，在临床中使用并不广泛。目前还没有商品化的IFA试剂盒。
IPT技术是欧盟参考实验室(National Reference Laboratories NRL)中选定的验证性测试，它是一种应用于固定细胞的免疫-细胞技术，通过过氧化物酶的作用来确定抗体抗原复合物的形成。它具有很高的灵敏度，该方法还可以检测多种种类的猪材料，如血液、渗出液组织或体液。Pastor等[26]在斑点免疫结合试验(DIA)的基础上，研制了一种硝酸纤维素试纸条检测ASFV，将可溶性抗原吸附在试纸上，通过过氧化物酶结合检测抗体，国内也有免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的研究，与三种ELISA试剂盒(针对p54蛋白的ELISA方法、针对p30蛋白的iELISA和针对p72的阻断ELISA)进行了对比，IPMA的符合率均在98%以上[27]。
4.3 IBT 对于针对ASF阳性或者可疑确诊的样品，进行IBT验证试验，其实验步骤是病毒纯化后进行SDS-PAGE电泳，通过电流将蛋白转到硝化纤维素膜上，阳性血清与膜上的抗原蛋白(IP 12、IP 23、IP 25、IP 25.5、IP 30、IP 31、IP 34 和 IP 35)反应，通过染色判断是否感染ASFV。膜上的蛋白质可以与急性期和恢复期猪血清发生反应，因为印迹条带大小的不同这个方法在理论上可以做到区分ASF的感染早期或晚期，具有很好的临床诊断应用前景。但该方法存在ASFV纯化困难、免疫印迹技术重复性不佳等问题，在临床上应用还需要进一步攻克难题。Kazakno[28]将p30蛋白与HIS标签链接，层析纯化得到了p30蛋白，在此基础上建立了基于p30的ASF血清学诊断免疫印迹方法，避免了原核表达的重组蛋白不与血清反应的影响，敏感性和特异性都得到了显著提升。
4.4 ICA 免疫层析法是将特定的抗体或抗原固定于载体的某一区带，在一段加入血清后由于毛细管作用，待检样品移动到固有区域发生抗原抗体特异性结合。传统免疫层析技术以胶体金为标记物，通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析。无需借助大型仪器，通过抗原抗体结合可以快速的实现检测分析。由孟康等将p72蛋白喷涂在标记物垫上，制得的胶体金检测试纸可快速地检出血清中ASFV抗体[29]。Sastre[30]在层析技术基础上研发抗原测定的侧流分析(LFA)，使黑色乳胶珠值结合抗p72单克隆抗体，检测血中的抗体，在10 min内得到检测结果。在临床进行ASFV检测时，使用最广泛和最成熟的免疫层析法为胶体金免疫层析试纸条，该方法操作简单，结果迅速，但该方法的敏感性不足，容易造成假阳性。随着新技术的发展，有研究使用截短的 p54 蛋白作为抗原，并将其与Eu掺杂的荧光微球作为示踪剂结合，特异性检测ASFV抗体[31]。由荧光微球标记的试纸条既保留胶体金快速的优点，也具有荧光素的高敏感性。
由于ASFV感染后抗体第1周产生并持续很长一段时间，因此血清学是诊断ASF的主要方法。我国从2018年传入ASF至今，ASF临床表现已由急性型临床特征转为亚急性型、低死亡率、临床症状不明显等弱毒株感染特征，由最初以qPCR技术为主的检测ASF到现在血清学检测抗体，血清学诊断应用逐步扩增。在ASF没有可用的商品化疫苗的情况下，血清学检测抗体阳性即表示着ASFV感染。
我国现阶段多采用ELISA方法进行血清学的检测，但由于ASFV结构复杂开放阅读框多，靶向抗原的选择以及重组蛋白的表达是ELISA方法建立的难点。WOAH建议在阳性ELISA的结果下需要通过其他方法确认，如IPT、IFA试验。基于ASFV感染细胞的检测方法，如IFA与IPT，对于诊断亚急性或隐匿型疾病非常有用，但涉及生物安全和标准化问题，很难在临床上进行大批量应用。随着ASF的大流行，迫切需要开发敏感性强、特异性高、适合于临床诊断的快速检测方法，如新型冠状病毒肺炎(COVID-19)免疫IgM/IgG 抗体检测方法[32]，通过硒纳米颗粒横向流动可以方便、快速、灵敏地检测人血清和血液中的抗SARS-CoV-2 IgM和IgG。随着技术发展，相信会有更加可靠的技术和产品推动ASF的有效防控。
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