基于YTHDC2、IGF2BP2和HNRNPC的头颈部鳞状细胞癌N6-甲基腺苷风险模型构建及临床应用评估
时间：2023-04-10 15:20:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
岳蔷薇 徐乐 张东升
山东第一医科大学附属省立医院口腔科，济南 250021
头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是全身最常见的恶性肿瘤之一，死亡率为40%～50%[1]。尽管肿瘤研究飞速进展，但HNSCC 总生存率仍未显著提高[2]，因此亟需新的预后评估分子标志物。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A） 是真核生物 RNA 中最常见的修饰方式[3-4]，异常表达的m6A 调节基因可能与HNSCC 发生发展密切相关[5]。肿瘤微环境是肿瘤生长的温床，其中浸润性免疫细胞如同双刃剑影响癌细胞[6]。研究[7-8]证实m6A RNA 甲基化与免疫功能密切相关。然而，在HNSCC 中关于肿瘤m6A RNA 甲基化、免疫功能和肿瘤临床特征之间的相关性仍不明确。因此，本实验基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA），通过生物信息学分析探索了HNSCC 中m6A 调节基因的表达、功能、临床意义及其与免疫功能之间的关系，为HNSCC预后和治疗提供指导。
1.1 数据获取和处理
在TCGA 数据库（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）中下载TCGA-HNSC 队列的转录组数据和临床数据，其中包括502个肿瘤样本和44个正常对照组织样本。临床数据主要包括肿瘤患者相应临床病理特征，包括年龄、性别、病理分级、肿瘤分期和生存数据。
1.2 m6A调节因子差异表达及相互作用分析
使用limma R包筛选肿瘤和正常样本之间的差异表达基因，筛选阈值设定为调整P值（adjustedPvalue，adj.P） <0.05，且差异倍数|log2FC|≥1。使用R 语言的ggplot2 软件包绘制差异基因提琴图及Pearson相关分析图。
1.3 m6A调节因子风险预后模型构建及评估
利用单因素COX 分析评估m6A 调节因子预后相关性，然后将P值小于0.05的预后相关基因进行LASSO 回归分析构建风险预后模型。通过将预后模型中每个基因表达量与相应风险系数的乘积相加，获得每位患者的风险评分。根据风险评分，HNSCC 患者被均匀地分为高风险组和低风险组。分别使用单因素和多因素独立预后分析评估m6A调节因子风险预后模型在HNSCC 患者预后评估中的临床价值，并使用R 语言的ggplot2 软件包绘制COX回归分析树叶图。
1.4 m6A风险组免疫微环境功能状态评估
使用xCell工具计算34个主要的免疫炎症细胞的丰度[9]，并绘制了雷达图展示了各细胞类型在高、低风险组中的分布差异。
1.5 数据统计
所有统计分析均在R 语言（版本4.1.2）中进行，P<0.05 被认为具有统计学意义。t检验和方差分析用于比较连续变量，卡方检验用于比较分类临床病理变量，Pearson 相关性分析用于满足正态分布的连续变量。
2.1 m6A调节因子的表达和相互关系
HNSCC 正常组织和肿瘤组织之间存在15个m6A 相关基因的异常表达（图1A）。除YTHDC2表达下降外，METTL3、METTL14、WTAP、KI‐AA1429、RBM15、FTO、ALKBH5、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 和HNRNPC 基因在肿瘤组织中均表达升高。15个差异表达的m6A 调节因子之间相互关联，形成了一个复杂的m6A调控网络（图1B）。
图1 TCGA HNSCC患者m6A调节因子差异表达及相互作用分析Fig 1 The expression profile and interrelation of m6A RNA regulators in TCGA HNSCC cohort
2.2 m6A调节因子风险预后模型构建及评估
通过单因素COX 回归分析，YTHDC2、IGF-2BP2 和 HNRNPC 与 HNSCC 患者预后显著相关（图2A）。其中，YTHDC2是HR小于1的保护基因（HR=0.846），而IGF2BP2（HR=1.015）和HNRN‐PC（HR=1.013）是风险基因。通过LASSO回归分析发现需要 YTHDC2、IGF2BP2 和 HNRNPC 3个基因共同构建风险预后模型，并得到风险评分公式如下：风险评分=（−0.169）×YTHDC2+（0.010）×IGF2BP2+（0.012）×HNRNPC。根据个体风险评分，分别将200 和186 名HNSCC 患者分为高风险组和低风险组。与低风险组相比，高风险组患者的总生存率显著降低（P=3.528×105，图2B）。高风险组和低风险组在性别（P<0.05）、病理分级（P<0.005）和临床分期（P<0.05）方面存在显著差异（表1）。在高风险组中，男性患者比例更高，且肿瘤分期和病理分级更高。
表1 HNSCC患者m6A风险分组的临床特征分析Tab 1 Clinical characteristics of HNSCC samples of m6A risk groups
单因素独立预后分析显示年龄（P=0.034，HR=1.406）、分期（P<0.001，HR=1.399）和风险评分（P=0.001，HR=1.683）与总生存率显著相关（图2C）。进一步的多因素独立预后分析将年龄（P=0.035，HR=1.418）、分期 （P<0.001，HR=1.430）和风险评分（P=0.003，HR=1.657）确定为独立的预后因素（图2D）。
图2 m6A调节因子风险预后模型构建及评估Fig 2 Construction and evaluation of the prognostic signature based on m6A regulators in TCGA HNSCC cohort
2.3 m6A风险组免疫微环境功能状态评估
在高、低风险组之间共有156个差异表达基因，其中35个基因表达上调，121个基因表达下调（图3A），其中涉及许多免疫相关基因（图3B）。为了进一步探索肿瘤免疫/炎症功能状态的差异，比较了高、低风险组中各细胞类型的丰度。如图3C 所示，其中大多数免疫细胞类型富集评分在高风险组中显著降低，例如B 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、M1 型巨噬细胞等。相反，高风险组的前B 细胞、辅助T 淋巴细胞富集分数更高。进一步挖掘前面所得到的m6A 风险分组相关的差异基因，发现抗肿瘤因子如γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素（interleukin，IL）-12A 和IL-12B 在高风险组中表达下调，而促肿瘤因子CD155 在高风险组中略有上调（图3D）。
图3 m6A风险分组HNSCC患者肿瘤免疫微环境功能状态分析Fig 3 Analysis of tumor immune microenvironment of different m6A risk groups in HNSCC
临床中常用TNM 分期指导肿瘤的诊断治疗，但有报道指出相同临床分期的HNSCC 患者会对治疗产生不同的反应，导致预后无法预测[10]，因此亟需提出新的分子标志物为HNSCC 预后评估和治疗选择提供参考。研究[3]发现m6A 甲基化在恶性肿瘤发生进展中发挥重要作用，然而在HNSCC 的研究仍不明确。本研究基于TCGA 数据库HNSCC 患者转录组及临床数据，通过生物信息学分析，阐明m6A 甲基化在HNSCC 预后评估中的重要价值，为HNSCC临床治疗提供了研究方向。
m6A 甲基化是RNA 中最丰富的修饰方式，其调节因子通常在恶性肿瘤中异常表达。与既往研究[11]结果相似。其中，甲基化转移酶包括MET‐TL3、 METTL14、 KIAA1427、 RBM15、 WTAP、ZC3H13，去甲基化酶包括FTO、ALKBH5，而m6A 结合蛋白通过识别并结合m6A 位点，发挥不同的RNA调节作用：维持RNA稳定性（IGF2BP1/2/3）、促进mRNA 翻译 （YTHDF1）、调控RNA 降解（YTHDF2）等。本研究发现HNSCC 肿瘤组织中m6A 调节因子呈现异常表达，17个调节因子中有15个表达失调，这表明m6A 调节因子可能与肿瘤发生和临床预后相关。而进一步相关性分析中发现这15个调节因子相互之间存在着表达相关性，这提示m6A 调控是一个复杂的网络。其中多项研究[12-14]已经证实 ALKBH5、METTL3 及 YTHDF1 在HNSCC发生和化疗耐受中发挥了重要调节作用。
然而，大多数异常表达的m6A 调节因子在HNSCC 中尚未有明确报道，这需要未来更深入的研究来揭示其潜在机制。
为了进一步明确m6A 调节因子在HNSCC 中的临床意义，本研究构建了由YTHDC2、IGF2BP2和HNRNPC 组成的风险预后模型。根据m6A 风险模型划分风险组，发现与低风险组相比，高风险组患者其肿瘤恶性程度更高，且伴随着较差的预后结果。并且与年龄和临床分期相同，该风险模型已被验证可以作为独立因素评价HNSCC 患者的预后。
在该预后模型中，YTHDC2 被预测为HNSCC预后评价的保护因子，表明它可能在HNSCC 中发挥抑癌基因作用。然而，YTHDC2 在肿瘤发生中的作用目前仍存争议。研究[15-16]发现在胰腺癌及肝癌中YTHDC2发挥促癌作用，这与本研究中YTH‐DC2 表现出的抑癌作用相矛盾。事实上，m6A 调节基因可能在不同类型癌症中发挥不同作用。例如，METTL3 在胶质母细胞瘤中充当肿瘤抑制基因[17]，而在膀胱癌中却能促进肿瘤进展[18]。因此，YTHDC2 在HNSCC 中的作用及机制需要进一步研究明确。与YTHDC2 不同，IGF2BP2 和HNRNPC是HNSCC 肿瘤发生的危险因素。抑制HNRNPC通过抑制下游干扰素反应，来抑制乳腺癌的生长[19]，而过表达HNRNPC 通过改变选择性切割和多聚腺苷化（alternative cleavage and polyadenyl‐ation，APA） 表达促进结直肠癌进展[20]；
同样IGF2BP2 可以通过调控性别决定区Y 盒状蛋白2 （sex determining region Y box protein 2，SOX2）表达来促进结直肠癌进展[21]。
尽管关于肿瘤m6A 修饰的研究日益增多，但其对肿瘤免疫微环境的影响尚未阐明。为此本研究比较了m6A 风险组之间的基因表达谱和免疫细胞类型富集评分。结果显示，高风险组患者免疫评分较低，且伴有大量细胞因子、趋化因子和相关受体表达失调。这提示m6A 甲基化修饰与肿瘤免疫调控密切相关。
进一步分析肿瘤微环境免疫细胞评分，发现大多数抗肿瘤免疫细胞在m6A 高风险组中浸润减少，主要包括M1 型巨噬细胞、树突状细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞，而免疫抑制性Th2淋巴细胞浸润显著增多，这表明m6A 异常调控与HNSCC 微环境的促肿瘤免疫状态相关。尽管 YTHDC2、IGF2BP2 和 HNRNPC 的免疫调节机制尚未阐明，考虑到m6A 基因是一个相互关联的调控网络，其他m6A 调控基因的免疫调节作用可以提供参考。研究[22]发现YTHDF2 可以通过CCR7-lncDpf3 参与调控树突状细胞迁移，并通过m6A 依赖方式促进IFNB 的mRNA 降解，进而抑 制 干 扰 素 反 应[23]。
除 YTHDF2 外 ， 敲 除YTHDF1 可以显著提高抗原特异性CD8+T 淋巴细胞抗肿瘤反应以及细胞程序性死亡-配体1（pro‐grammed cell death ligand 1，PD-L1）阻断剂的治疗效果[8]。而METTL3 可以通过增加TRIAP、CD40和CD80 的翻译来促进树突状细胞激活[24]。这提示m6A 调节基因参与了免疫微环境调控。为了探索潜在机制，分析了m6A 风险组之间的免疫调节因子表达。结果表明，在高危组中，免疫刺激因子包括IFN-γ、IL-12A/B 的表达显著降低，而免疫抑制因子CD155 的表达略有上调。这与免疫抑制的肿瘤微环境免疫状态相一致，再次验证了m6A 调节基因在免疫调节中发挥重要作用。
综上所述，基于m6A调节因子YTHDC2、IGF-2BP2 和 HNRNPC 构建的 HNSCC 风险预后模型可以作为新的生物标志物，评判HNSCC 患者预后，而异常的m6A 调节与肿瘤微环境免疫状态密切相关。因此，m6A RNA 甲基化可能成为一个潜在的治疗靶点，不仅可以杀死肿瘤细胞，还可以辅助抗肿瘤免疫治疗。
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
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