类风湿关节炎患者血清miR-125a-5p、miR-132的表达及意义*
时间：2023-04-10 09:40:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
蒋磊，方兴刚，兰培敏，陈汉玉
(湖北省十堰市太和医院&湖北医药学院附属医院中西医结合科，湖北十堰 442000)
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是以全身关节炎症状改变为主要特征的疼痛性自身免疫性疾病，发病时间可为几天、几周或几个月，且存在不同程度的活动期[1]。miRNA存在于血液和尿液等体液中，且在体液中可以稳定存在[2]。有学者发现，miR-125a在慢性炎症性疾病中的表达水平失调[3]。miR-125a可通过调控调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)稳态以促使自身免疫性疾病发生[4]。miR-132在癌症、免疫系统性疾病中发挥重要作用，研究发现，在RA患者外周血中miR-132的表达量显著下调，且与RA密切相关[5]。本研究通过检测miR-125a-5p、miR-132在RA患者和体检健康者血清中的表达水平，以期探讨二者之间的关系，并分析其在RA筛查中的临床意义。
1.1研究对象 选取2021年1月至2022年1月湖北省十堰市太和医院中西医结合科收治的92例RA患者作为RA组，其中男性36例，女性56例，年龄(38.50±4.25)岁，平均病程(5.50±1.70)年。纳入标准：符合《2018中国类风湿关节炎诊疗指南》的RA诊断标准[6]。排除标准：(1)患结核或者结核感染者；
(2)患其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及肝脏、肾脏功能异常者；
(3)患者伴有精神疾病或认知功能障碍，无法配合完成本研究；
(4)使用过糖皮质激素及其他免疫抑制剂药物治疗的患者。选取同期在本院体检健康者80例作为健康人对照组，其中男性32例，女性48例，年龄(39.50±4.75)岁。两组间性别、年龄等一般资料比较的差异无统计学意义(χ2=0.014，P=0.907；
t=1.457，P=0.147)，具有可比性。本研究经湖北省十堰市太和医院医学伦理委员会审核批准(批准文号：20201213)，患者均知情同意。
1.2主要仪器及试剂 Biosystems 7300 real-time PCR仪(上海实维实验仪器技术有限公司)，Think-lab实验室超纯水机(上海浚和仪器科技有限公司)，离心机(Eppendorf 艾本德中国有限公司)，SpectraMax iD5型酶标仪(美谷分子仪器有限公司)，PUZS-300型全自动生化分析仪(上海帝博思生物科技有限公司)，分光光度计(上海远耀生物科技有限公司)。氯仿、异丙醇、无水乙醇(南京森贝伽生物科技有限公司)，DEPC水(上海炟雅生物科技有限公司)，TRIzol试剂(赛默飞世尔科技公司)，逆转录试剂盒(北京思科诺思生物科技有限公司)，qRT-PCR试剂盒(SYBR Green PCR Master Mix，北京凯诗源生物科技有限公司)。
1.3方法
1.3.2标本采集、RNA提取及逆转录反应 RA组患者于入院后治疗前第二天清晨，体检健康者于体检当日清晨分别采集空腹静脉血3 mL，4 500 r/min离心15 min，分离上清，将血清样本置于-80 ℃保存。采用TRIzol试剂提取血清总RNA。采用逆转试剂盒对分离的RNA进行逆转录反应。使用分光光度计检测cDNA/RNA的浓度和纯度， 取吸光度(A260 nm/A280 nm)值在1.8～2.0之间，浓度>25 ng/μL的样本，置于-80 ℃保存待用。
1.3.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 所有引物均采用Primer Premier 5.0软件设计，并由西安擎科生物科技有限公司合成。miR-125a-5p上游引物序列：5′-CTGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游引物序列：5′-CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT-3′，退火温度为58 ℃，产物片段大小为101 bp；
miR-132上游引物序列：5′-ACGACGTGTAGCTTATAAGACTG-3′，下游引物序列：5′-ACTGCTTGTTCTACACACTGTG-3′，退火温度为60 ℃，产物片段大小为110 bp；
U6上游引物序列：5′-GAGGCACAGCGGAACG-3′，下游引物序列：5′-CTACCACATAGTCCAGG-3′，退火温度为60 ℃，产物片段大小为106 bp；
使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒在Biosystems 7300 real-time PCR仪中进行PCR反应。qRT-PCR总反应体系为20 μL，包括cDNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，SYBR Green PCR Master Mix10 μL，ddH2O 7.4 μL。循环参数：96 ℃ 10 min，94 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，共45个循环。以U6作为内参照。miR-125a-5p及miR-132的表达水平用2-ΔΔCt法计算。
2.1两组实验室指标的比较结果 与健康人对照组相比，RA组ESR、RF、CRP和miR-125a-5p的表达水平均显著升高，miR-132的表达水平显著降低，差异具有统计学意义。见表1。
表1 两组实验室指标的比较结果
2.2不同活动组miR-125a-5p、miR-132水平与DAS28评分比较结果 高活动组RA患者miR-125a-5p的表达水平与DAS28评分显著高于中活动组和低活动组，且中活动组显著高于低活动组；
高活动组RA患者miR-132的表达水平显著低于中活动组和低活动组，且中活动组显著低于低活动组(P<0.05)。见表2。
表2 不同活动组miR-125a-5p、miR-132水平和DAS28评分比较
2.3RA患者miR-125a-5p与miR-132的相关性以及二者与DAS28评分和各实验室指标的相关性 Pearson相关性分析结果显示，RA患者血清miR-125a-5p、miR-132的表达水平呈负相关(r=-0.398，P<0.001)。RA患者血清miR-125a-5p与DAS28评分、ESR、RF、CRP呈正相关；
而miR-132的表达水平与DAS28评分、ESR、RF、CRP呈负相关。见表3。
表3 RA患者miR-125a-5p、miR-132与DAS28评分以及各实验室指标的相关性
2.4ROC曲线评估血清miR-125a-5p、miR-132对RA的筛查价值 选取RA患者和健康人对照组进行ROC曲线分析，结果显示二者联合检测筛查RA的AUCROC显著高于miR-125a-5p、miR-132单独筛查(Z=3.638，P<0.001；
Z=3.184，P=0.023)，见图1、表4。
图1 ROC曲线分析
表4 miR-125a-5p、miR-132筛查RA的效能比较
本次研究结果表明，RA患者血清miR-125a-5p的表达水平较健康人对照组显著升高，提示miR-125a-5p可能作为RA的潜在生物学标志物。有学者发现，活动性关节炎患者的单核细胞中miR-125a-5p的表达量增加，且与该疾病进展密切相关[7]。本研究结果发现，高活动组RA患者miR-125a-5p的表达水平和DAS28评分显著高于中活动组和低活动组，中活动组显著高于低活动组，表明miR-125a-5p与RA的疾病活动程度有关，参与了RA的发展。Pearson相关性分析显示，RA患者血清miR-125a-5p与DAS28评分、ESR、RF、CRP呈正相关，表明miR-125a-5p与RA的炎症反应及病情进展有关，但该结论需要增加样本数量，进一步深入探究miR-125a-5p参与RA的发展机制。
miR-132在神经元发育和新陈代谢中发挥多种作用[8]。它抑制许多促炎因子，包括转录共激活因子、生长因子、多巴胺能调节剂和表观遗传调节剂等，参与炎症反应进程。有学者通过生物信息学分析发现，miR-132可以靶向调控多种IL因子，参与RA的发展过程[9]。另有研究表明，miR-132在RA患者外周血中的表达水平显著低于健康人对照组，其水平随疾病活动度的增加而减少[5]。本研究证实，miR-132的表达水平较健康人对照组显著降低，表明miR-132参与了RA的发病过程。骨关节炎是一种由于关节退行性病变导致关节软骨受损而引起的慢性疾病，该病早期与RA有相似之处，与健康健康人对照组相比，骨关节炎患者的miR-132表达水平降低[9]。笔者发现，高活动组RA患者miR-132的表达水平显著低于中活动组和低活动组，且中活动组显著低于低活动组，提示miR-132有望成为RA的潜在标志物。本研究还发现，miR-132的表达水平与DAS28评分、ESR、RF、CRP呈负相关，提示miR-132与RA的炎症反应有关，参与了RA的发病过程并评估病情的发展过程。
笔者通过相关性分析证实，RA患者血清miR-125a-5p、miR-132的表达水平呈负相关，表明二者共同参与了RA的进展进程。二者联合检测筛查RA发生的AUCROC值显著高于miR-125a-5p、miR-132单独筛查的AUCROC值，提示二者联合检测能提高RA筛查的效能，或可成为RA的潜在生物学标志物。
综上所述，RA患者血清miR-125a-5p呈高表达，miR-132呈低表达，且二者呈负相关关系。二者在RA的发病以及进展中发挥重要作用，对RA的筛查有一定的临床价值。本次研究的不足之处是未进行治疗前后两指标表达水平的比较。因RA的机制较复杂，后续笔者将进一步扩大研究样本量，以期为RA的研究提供更多的参考依据。
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