褐飞虱clip丝氨酸蛋白酶基因NlCSP4的克隆及功能分析

邬 伟，程依情，王正亮，俞晓平

（中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，杭州 310018）

Clip丝氨酸蛋白酶（clip-domain serine protease，CSP）是广泛存在于昆虫等节肢动物体内的一类结构保守、功能多样的蛋白质水解酶类[1]。CSP蛋白质序列一级结构的N-末端和C-末端分别存在clip结构域（至少1个）和催化结构域，其中clip结构域一般由30～60个氨基酸残基组成，含有6个保守的Cys残基，并形成3对二硫键以维持空间结构稳定；
催化结构域含有特异性保守的His-Asp-Ser催化三联体，并分别存在于TAAHC、DIAL和GDSGG三个保守基序中，其发生缺失或突变会严重影响酶的催化活性[2]。研究表明，CSP在胞内一般以无活性的酶原形式存在，需要在特定位点经蛋白酶剪切后才具有活性，活化后的CSP可通过介导蛋白酶水解级联反应来精密调控昆虫胚胎发育、蜕皮生长和免疫防御等诸多生理过程[3-6]。

节肢动物CSP首次在中国鲎Tachypleus tridentatus的血淋巴中被发现[7]，之后陆续在各种昆虫体内被检测到[7-11]。迄今为止，已在家蚕Bombyx mori[12]、烟草天蛾Manduca sexta[13]、黑腹果蝇Drosophila melanogaster[14]和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica[15]等昆虫全基因中分离鉴定到百余种CSP，如在烟草天蛾和黑腹果蝇体内分别鉴定到42和37个CSP[13,14]。当前，关于CSP的生物学功能研究主要集中于果蝇和家蚕等模式昆虫中。研究显示，不同于通过对食物蛋白的酶解消化而参与昆虫营养代谢的丝氨酸蛋白酶，CSP主要通过对蛋白酶原的激活或抑制等信号级联传递方式来调节昆虫的生长、发育和免疫等生理过程[16-18]。Liu等[12,19]通过全序列比对的方法从家蚕全基因组中分离鉴定了26个CSP编码基因，定量表达分析显示CSP具有明显的时空表达特异性，且其中5个CSP的表达水平受到病原微生物的显著诱导，通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术敲低其中一个CSP编码基因（BmSP95）可导致家蚕幼虫化蛹周期显著延长。Sousa等[20]从冈比亚按蚊Anopheles gambiae体内成功克隆到一个丝氨酸蛋白酶基因，序列分析显示其隶属CSP，功能分析表明其可通过调控蚊虫血淋巴的黑化反应来免疫防御外来病原微生物（如大肠杆菌和疟原虫）的入侵。近年来，关于CSP参与昆虫生长发育和免疫防御的研究在一些重要农业害虫，如西花蓟马Frankliniella occidentalis[21]、烟粉虱Bemisia tabaci[22]、桃蚜Myzus persicae[23]和烟草甲Lasioderma serricorne[5,24]中也取得了一定的进展。如烟草甲CSP基因LsCLIP3受20-羟基蜕皮激素和肽聚糖诱导表达，基因RNAi敲低导致烟草甲成虫羽化率显著降低，且幼虫体内几丁质含量明显下降，同时对病原细菌敏感性显著提高[5]。

褐飞虱Nilaparvata lugensStål属半翅目Hemiptera飞虱科Delphacidae，是我国水稻上的一种随季风迁移、r-对策型的单食性害虫，通过刺吸水稻韧皮部汁液、产卵和传播病毒病等方式产生为害，严重影响水稻质量和产量[25]。鉴于CSP在昆虫生长、发育和免疫等诸多生理过程中的重要功能，褐飞虱CSP基因极有可能成为防治褐飞虱的理想靶标。为此，本研究克隆鉴定了一个褐飞虱 CSP编码基因NlCSP4，通过qRT-PCR技术分析了其时空表达规律以及病原微生物诱导表达模式，并利用RNAi技术探明了其在褐飞虱生长发育和免疫防御过程中的生物学功能，以期为开发基于CSP的褐飞虱防治新技术提供理论依据。

1.1 供试昆虫、植物和病原微生物

供试褐飞虱种群在人工气候室内以TN1水稻苗饲养。饲养条件为：温度（24±1）℃、光周期为16L∶8D、相对湿度为70%±5%。TN1水稻种植条件同褐飞虱饲养条件，待分蘖期后用于试验。大肠杆菌Escherichia coli菌株ATCC35150和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus菌株CMCC26003保存于LB培养基中，37 ℃培养传代；
金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae菌株Ma456保存于PDA斜面培养基，25 ℃培养传代。

1.2 褐飞虱RNA提取及cDNA合成

根据MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书提取褐飞虱总RNA，利用微量分光光度计NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific，美国）和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和浓度。以检测合格后的RNA为模板，使用PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，日本）试剂盒参照说明书合成第一链cDNA，并于-80 ℃保存备用。

1.3 NlCSP4基因克隆及序列分析

基于课题组测得的褐飞虱转录组数据，结合褐飞虱全基因组信息[26]，获得一条编码褐飞虱CSP的全长cDNA序列NlCSP4。为进行克隆验证，采用Primer Premier 5设计2对PCR引物（表1）分别扩增NlCSP4序列的5′端和3′端，再拼接获得全长cDNA序列。PCR扩增以1.2节所得褐飞虱cDNA为模板，反应体系为50 μL，包含10×Ex Taq buffer（Mg2+plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，cDNA模板 2 μL，Ex Taq酶 0.5 μL 和 ddH2O 36.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性 3 min；
94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸2.0 min，35个循环；
72 ℃延伸10 min。利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，目标条带经割胶回收后连接至pMD18-T克隆载体（TaKaRa，日本），并转化入大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞DH5α中。经涂布和挑斑检测后，将阳性转化子送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，序列确认无误后进行后续分析试验。

利用NCBI在线程序ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测NlCSP4基因的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），并翻译获得蛋白质序列；
使用 ExPASy网站 Compute pI/Mw tool（https://web.expasy.org/compute_pi/）预测蛋白质分子量大小及等电点；
通过SMART server（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析编码蛋白序列中的保守结构域；
运用 SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽序列；
利用BLASTP（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）搜索比对其他昆虫CSP同源序列，并通过MEGA X软件进行氨基酸序列比对和邻接法系统发育树构建[27]。

1.4 NlCSP4基因表达模式分析

利用SYBR®Premix Ex TaqTMII试剂盒（TaKaRa，日本）对NlCSP4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及不同病原微生物诱导条件下的表达模式进行qRT-PCR检测，以褐飞虱18S rRNA作为内参基因，引物序列见表1。分别收集褐飞虱卵、蜕皮24 h后的1～5龄若虫、羽化后24 h的雌、雄成虫以及雌成虫的脂肪体、肠道和卵巢3种不同组织样品，各样品设置3次生物学重复；
将以PBS配制的浓度为1×107个/mL的病原细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）菌体悬液和病原真菌（金龟子绿僵菌）分生孢子悬液，以及相同体积（10 nL）的PBS溶液用显微注射仪分别注射接种褐飞虱5龄若虫3个不同批次，分别收集接种后0 h、12 h、24 h、36 h、48h、60 h和72 h的七组褐飞虱活体。各收集样品按1.2节所述方法进行RNA提取和cDNA合成。qRT-PCR体系为20 μL，包含 2×SYBR®Premix Ex TaqTMII 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL（表1），适量稀释的cDNA 2 μL和ddH2O 6 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个扩增循环。NlCSP4基因相对表达量用2-ΔΔCt法计算[28]。

1.5 基于RNAi的NlCSP4基因功能分析

基于NlCSP4和绿色荧光蛋白GFP（对照）基因的cDNA序列，通过E-RNAi在线网站（https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php）设计dsRNA合成引物（表1）。参照 T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega，美国）试剂盒说明书分别合成dsNlCSP4和dsGFP，并用NanoDrop ND-2000和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度。

表1 本研究所用引物序列信息Table 1 Primers used in this study

以褐飞虱5龄若虫为试虫，在体视显微镜下用显微注射仪于中足和后足基节之间胸部注射dsRNA，注射剂量为50 ng/头。每个处理设3个生物学重复，每个重复40头试虫。平行设置四组实验：第一组用于测定RNAi干扰效率，分别收集dsNlCSP4和dsGFP注射后2 d、4 d、6 d和8 d的褐飞虱活体，按1.2节所述方法进行RNA提取和cDNA合成，按1.4节所述qRT-PCR方法检测不同时间点NlCSP4的表达水平；
第二组用于检测RNAi对褐飞虱存活率的影响，连续10 d定时统计dsNlCSP4和dsGFP注射后褐飞虱的存活率；
第三组用于评估NlCSP4在褐飞虱免疫防御病原真菌过程中的作用，在dsNlCSP4和dsGFP注射褐飞虱试虫后，以喷雾法分别接种1 mL浓度为1×108个/mL的金龟子绿僵菌分生孢子悬液（0.02% Tween 80水溶液配置），置于人工气候室中饲养10 d，逐日定时观察记录死亡数，并将虫尸移出保湿培养，以确认是否为真菌感染致死。以喷雾0.02% Tween 80的处理作为空白对照。第四组用于检测dsRNA和病原真菌联合处理后NlCSP4的表达动态，褐飞虱处理方案与第三组试验相同，并于处理后2 d、4 d、6 d和8 d收集褐飞虱活体，分别按1.2节和1.4节所述方法进行cDNA合成和qRT-PCR检测。

1.6 数据统计与分析

采用 DPS软件分析与处理实验数据[29]。利用单因素方差分析（one-way ANOVA）及 Tukey’s HSD（Tukey’s honestly significant difference）法进行差异显著性检验，差异显著性水平为P＜0.05。利用Graphpad Prism 7.0软件作图。

2.1 NlCSP4基因的克隆及序列特征

基于褐飞虱转录组数据和褐飞虱全基因组序列信息获得NlCSP4基因全长cDNA序列（GenBank登录号：OK018340），并进行克隆和测序验证。结果表明，NlCSP4的ORF全长1 911 bp，编码636个氨基酸，预测分子量大小为69.29 kD，等电点9.02。信号肽预测表明NlCSP4蛋白包含一个长度为25个氨基酸残基的信号肽。SMART预测显示NlCSP4氨基酸序列在N-末端第274～317位氨基酸残基之间含有一个CSP特有的Clip结构域，在C-末端第391～630位氨基酸残基之间含有一个trypsin-like serine protease（tryp_spc）催化结构域。其中Clip结构域中含有可形成3对二硫键的6个保守Cys残基，催化结构域含有保守的催化三联体活性位点（His436、Asp491和Ser587）（图1）。

图1 褐飞虱NlCSP4基因cDNA序列及其编码氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and the encoded amino acid sequence of NlCSP4 of Nilaparvata lugens

2.2 NlCSP4蛋白的序列比对及进化树

BLAST比对结果表明，NlCSP4氨基酸序列与褐飞虱全基因组中预测的两种CSP家族蛋白（GenBank登录号分别为AGK40916和XP_039283318）氨基酸序列同源性最高（＞90%）。与其他昆虫CSP相比，序列相似性最高的为草翅叶蝉Homalodisca vitripennisCSP（GenBank登录号：
KAG8310468），其次为温带臭虫Cimex lectulariusCSP（GenBank登录号：XP_014241309），两者氨基酸序列一致性为分别为67.73%和66.18%。系统发育分析显示，NlCSP4与所有其他同属半翅目昆虫的CSP在NJ树上聚为一支，并与蜚蠊目昆虫CSP互为姐妹群，而与鞘翅目和鳞翅目昆虫CSP亲缘关系较远（图2）。

图2 基于褐飞虱NlCSP4和其他昆虫CSP氨基酸序列采用邻接法构建的系统发育树（1000次重复）Fig.2 Phylogenetic tree of NlCSP4 and other insect CSPs based on amino acid sequences by neighbor-joining method (1000 replicates)

2.3 NlCSP4基因时空表达特征

qRT-PCR结果显示，NlCSP4基因在褐飞虱不同发育阶段均有表达。雌成虫中NlCSP4的表达量最高，分别是卵、3龄若虫和雄成虫表达量的9.0、2.2和2.8倍。在若虫期，NlCSP4的表达量随虫龄的增长而逐步上调，如其在5龄若虫中的表达量较1龄和3龄若虫分别增加了4.8和1.8倍，均达到显著水平（P＜0.05）（图3A）。NlCSP4基因在羽化后24 h的雌成虫脂肪体、肠道和卵巢组织中均有不同程度表达，且在脂肪体中表达量最高，分别是肠道和卵巢组织中表达量的2.1和9.5倍（图3B）。

图3 NlCSP4在褐飞虱不同发育时期（A）和雌成虫不同组织（B）中的表达模式Fig.3 Expression profiles of NlCSP4 during different developmental stages (A) and different tissues of the female adults (B) of Nilaparvata lugens

2.4 NlCSP4基因微生物诱导表达模式

褐飞虱5龄若虫NlCSP4基因在不同微生物诱导条件下的表达模式如图4所示。与对照组（注射PBS水溶液）相比，大肠杆菌诱导72 h内各时间点NlCSP4表达量除在48 h和60 h时呈现小幅上调并达到显著水平外，其余均无显著差异（P＞0.05）。然而，金黄色葡萄菌和金龟子绿僵菌可显著诱导NlCSP4的表达，且以金龟子绿僵菌尤为突出。在金黄色葡萄菌和金龟子绿僵菌刺激12 h后，NlCSP4表达量较对照分别上调了1.7和12.4倍。随着诱导时间的增加，NlCSP4表达量进一步显著上调，且在金黄色葡萄菌诱导60 h和金龟子绿僵菌刺激48 h时达到顶峰。如金龟子绿僵菌诱导48 h后，NlCSP4表达量分别是诱导24 h和72 h的2.9和2.0倍。

图4 褐飞虱5龄若虫NlCSP4的微生物诱导表达模式Fig.4 Expression pattern of NlCSP4 in the fifth instar nymphs of Nilaparvata lugens after microbial infection

2.5 RNAi对NlCSP4的干扰效率

通过qRT-PCR技术检测RNAi对褐飞虱5龄若虫体内NlCSP4的干扰效率，结果表明，与对照组（注射dsGFP）相比，显微注射dsNlCSP4不同时间点后NlCSP4的表达量均呈现显著下调趋势。如图5所示，显微注射NlCSP4的dsRNA 2 d、4 d、6 d和8 d后，NlCSP4的表达量水平较对照组分别下降了83.9%、88.6%、59.1%和44.1%，均达到显著水平（P＜0.05）。可见，合成的dsNlCSP4片段可有效抑制NlCSP4的表达。

图5 RNAi后褐飞虱5龄若虫NlCSP4的相对表达量Fig.5 Relative expression levels of NlCSP4 in the fifth instar nymphs of Nilaparvata lugens after RNAi

2.6 NlCSP4干扰对褐飞虱存活率和抵御病原真菌侵染能力的影响

统计结果显示，抑制NlCSP4的表达能显著降低褐飞虱5龄若虫的存活率，如显微注射dsNlCSP4 8 d后，褐飞虱5龄若虫的存活率为68.9%，显著低于对照组（注射dsGFP）的92.7%。生物测定试验表明，NlCSP4干扰后褐飞虱对病原真菌侵染的抵御能力显著下降。与对照组（注射dsGFP）相比，dsNlCSP4处理组褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和10 d后的校正死亡率分别提高了35.1%和21.1%（图6A）。金龟子绿僵菌对dsNlCSP4处理组褐飞虱5龄若虫的半致死中时（LT50）为 3.9 d，显著低于dsGFP对照组的5.4 d（图6B）。qRT-PCR分析结果显示，对照组（注射 dsGFP）和处理组（注射dsNlCSP4）褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染6 d内各时间点NlCSP4表达量均显著上调。然而，与注射dsGFP的对照组相比，dsNlCSP4处理组各时间点NlCSP4表达量均受到显著抑制，如dsNlCSP4处理组褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染2 d和4 d后NlCSP4的表达水平较对照组（注射dsGFP）下降程度均超过80%，与2.5节中NlCSP4干扰效率检测结果基本一致（图6C）。

图6 注射dsRNA和接种金龟子绿僵菌后褐飞虱5龄若虫的存活率（A）、半致死中时（B）和NlCSP4的相对表达量（C）Fig.6 The survival rates (A), LT50 values (B) and relative expression level of NlCSP4 (C) in the fifth instar nymphs of Nilaparvata lugens after dsRNA injection and M.anisopliae infection

作为丝氨酸蛋白酶超家族中的重要成员，clip丝氨酸蛋白酶在昆虫生长、发育、繁殖和免疫等生理过程中发挥重要调控作用，是进行害虫防治的有效潜在靶标[3-6]。随着组学和生物信息学技术的快速发展，大量的昆虫clip丝氨酸蛋白酶基因已被成功检测和鉴定[11-15]。基于褐飞虱基因组和转录组数据，Bao等[30]从褐飞虱基因组中预测到12种clip丝氨酸蛋白酶的完整或部分基因编码信息，并分析了其中6种clip丝氨酸蛋白酶基因的在褐飞虱不同发育阶段和不同组织部位的表达规律。本研究在此基础上，成功克隆和鉴定了NlCSP4基因的全长cDNA序列，分析了其时空表达规律和微生物诱导表达特征，并初步研究了其在褐飞虱生长发育和免疫防御过程中的作用。

氨基酸序列分析表明NlCSP4具有clip丝氨酸蛋白酶的典型特征，即蛋白质N端和C端分别存在一个保守的clip结构域和Tryp_SPc结构域。多序列比对显示，与已经鉴定的其它昆虫clip丝氨酸蛋白酶一样，NlCSP4的clip结构域中含有可组成三对二硫键的6个Cys残基，且Tryp_SPc结构域中亦具有特异性保守的由His、Asp、Ser残基组成的催化中心三元件。目前研究显示，丝氨酸蛋白酶类分子为分泌型蛋白，其N端一般存在信号肽或透膜区，如家蚕中所有检测到的26个clip丝氨酸蛋白酶均含有信号肽，黑腹果蝇中2个clip丝氨酸蛋白酶则以透膜区代替信号肽行使分泌功能[9,14]。与上述研究结果类似，SignalP预测显示NlCSP4在蛋白质N端（第1～25位氨基酸残基）亦存在信号肽序列，表明NlCSP4极可能以分泌型蛋白酶形式发挥功能。系统发育分析表明，昆虫CSP蛋白在进化上相对保守，NlCSP4与同属半翅目昆虫的CSP蛋白在NJ进化树上聚为一支，暗示它们可能具有相似的生物学功能。

qRT-PCR分析结果显示，褐飞虱NlCSP4基因具有明显的时空表达特异性。与褐飞虱中另一个CSP编码基因Snake4在5龄若虫期高表达的结果类似，NlCSP4表达量在从卵到5龄若虫发育过程中逐步上升，表明其在褐飞虱胚胎发育和若虫生长过程中发挥重要作用[31]。NlCSP4的这种龄期特异性表达模式同样见于其它昆虫中，如榨蚕Antheraea pernyi的CSP编码基因ApSnake在高龄幼虫期（4龄和5龄）表达量显著高于卵期和1～3龄幼虫期[32]。NlCSP4在褐飞虱脂肪体、肠道和卵巢等组织部位均有表达，但在免疫相关器官脂肪体中的表达量显著高于消化系统肠道。这一表达模式与烟草甲[24]、黄粉虫Tenebrio molitor[33]和水椰八角铁甲Octodonta nipae[34]等昆虫相关CSP基因表达特征研究的结果吻合，如烟草甲4个CSP编码基因（LsCLIP1～4）均在脂肪体中呈现高水平表达，而在肠道组织中表达较低[24]。

不同微生物诱导结果显示，NlCSP4表达水平受到金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）和金龟子绿僵菌（丝状病原真菌）显著诱导，但大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）短时间（36 h内）诱导效果不明显。类似现象同样见于其它昆虫CSP编码基因的微生物诱导表达模式研究，如烟草天蛾MsHP8和黑腹果蝇SPE基因可被藤黄微球菌Micrococcus luteus（革兰氏阳性细菌）和球孢白僵菌Beauveria bassiana（丝状病原真菌）或真菌细胞壁多糖（β-1,3-葡聚糖）显著激活，但不受革兰氏阴性细菌诱导[35,36]。然而，蝶蛹金小蜂Pteromalus puparumCSP编码基因PpcSPH1的表达水平在革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和丝状病原真菌诱导下均呈现显著上调趋势[37]。可见，针对不同的入侵微生物种类，昆虫CSP介导的免疫防御反应的程度或途径不尽相同。本研究结果表明，NlCSP4主要参与褐飞虱对革兰氏阳性细菌和丝状病原真菌的免疫响应，而在免疫防御革兰氏阴性细菌入侵过程中的贡献相对较小。

RNAi技术可高效特异的抑制靶标基因的转录表达，在昆虫基因功能解析、基因表达调控和害虫防治等研究领域具有极大的应用价值[38]。qRT-PCR检测结果显示，本研究合成的NlCSP4基因dsRNA能有效干扰目标基因的表达。NlCSP4沉默后褐飞虱5龄若虫存活率显著下降，证实NlCSP4参与了褐飞虱的生长发育过程。Wu等[39]和Zheng等[40]应用RNAi技术分别研究了褐飞虱CSP编码基因NlPCE3在雌雄成虫中的生物学功能，结果显示沉默NlPCE3可导致雌雄成虫生殖组织（卵巢和输精管）发育严重受阻，雌虫产卵量显著降低。由此可见，包括NlCSP4在内的褐飞虱CSP基因可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标。利用昆虫病原真菌防治褐飞虱亦是褐飞虱生物防控的一种优选策略，其中绿僵菌已被证实在防治褐飞虱中具有极大的应用潜能[41,42]。生物测定试验显示，金龟子绿僵菌侵染与dsNlCSP4注射联合处理能显著提高金龟子绿僵菌对褐飞虱的致死速度，表明病原真菌侵染和靶标基因RNAi对褐飞虱的致死作用具有协同效应。本研究结果可为褐飞虱的防治提供新的思路，如后续可研究绿僵菌作为 dsRNA递送载体的可行性，将RNAi和病原真菌介导的害虫防治技术优势相结合，从而显著提高褐飞虱防控效果。

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