生菜bHLH转录因子家族的鉴定与生物信息学分析
时间：2023-03-24 11:15:07 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
隋心意，赵小刚，毛 欣，李亚灵，温祥珍
（山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801）
bHLH转录因子是广泛存在于动物、植物中的转录因子超家族，因其含有‘螺旋-环-螺旋’结构域而得名[1]。bHLH结构域由50～60个氨基酸组成，包括N端的碱性区(Basic region)和C端HLH区(Helix Loop Helix)[2]。其中N端的碱性区域由10～15个氨基酸组成，植物中50%以上的碱性氨基酸区含有高度保守的H5-E9-R13(His5-Glu9-Arg13)序列，该序列通过和特定DNA的顺式作用元件结合激发基因转录；
HLH区域主要由40个左右的疏水性氨基酸组成，有利于HLH区域二聚体的形成和蛋白质二级结构的稳定[3-4]。依据进化关系、基因功能、与DNA的结合模式，动物中bHLH转录因子被分为 6个组(A、B、C、D、E、F)，45个家族[5]。与动物相比，植物的bHLH蛋白较少，大多数植物bHLH蛋白在动物家族分类中属于B组[6]。目前在拟南芥中鉴定出了162个bHLH家族转录因子，与水稻中的bHLH转录因子一起被分成了25个亚家族[7-9]；
将水稻中的165个转录因子分为22个亚家族[9]，将拟南芥中161个转录因子分为21个亚家族[10]；
PIRES等[11]利用对来源于藻类和陆生植物的500多个bHLH蛋白的分析，将植物bHLH蛋白分为26个亚家族。随着全基因组测序技术的发展，越来越多物种中的bHLH转录因子正在被鉴定出来。
在拟南芥中的大量研究表明，bHLH转录因子参与了形态建成、生长发育、抗逆反应、信号转导和次生代谢等多种生物学过程[2,12]，比如PIF4参与调控拟南芥下胚轴的伸长过程[13]，GL3和EGL3基因控制根表皮的细胞分化[14]，EMBRYO1基因控制胚胎发育[15]，DYTl控制绒毡层的分化和发育[16]，SPATULA基因控制雌蕊的发育[17]；
同时有研究表明AtbHLH112对抗盐、抗旱和抗渗透胁迫有正调控作用，但抑制根系发育[18-19]，OsHLH013和OsHLH016调控花青素的生物合成，PIF3和PIF4在光敏色素信号传导中起调控作用[13,20]。在水稻的大量研究中表明bHLH转录因子在气孔发育、腋芽原基形成、胚乳发育、种皮颜色、铁元素吸收利用、耐盐性和抗旱性方便也发挥着非常重要的作用。
生菜(Lactuca sativa L.)又名叶用莴苣，为菊科菊苣属一年生草本植物，富含维生素C、维生素E、叶酸、多酚、膳食纤维、生育酚和类胡萝卜素等营养物质，是日常生活不可或缺的蔬菜之一[21]。随着生菜全基因组数据的公布，有必要对生菜bHLH家族基因进行全基因组挖掘和全面、系统分析。因此本研究计划使用生物信息学的方法，从基因组水平上对生菜bHLH家族的蛋白特性、保守域结构、内含子与外显子数量、motif分布和功能分化等方面进行研究，以期为生菜bHLH家族基因的克隆、功能解析提供理论基础。
1.1 数据来源
从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载生菜基因组数据和蛋白组数据，通过Pfam(http://pfam.xfam.org/)数据库中下载bHLH结构域的隐马氏模型（登录号为：PF00010）。利用HMMER3.0软件，以隐马氏模型文件PF00010对生菜蛋白组数据进行搜索，获得生菜中含有bHLH结构域的候选蛋白家族成员的蛋白序列。用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)数据库比对得到的蛋白序列，将无bHLH结构域的序列剔除，确定最终候选基因。
1.2 生菜bHLH蛋白的特性分析
通过ExPASy ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)预测bHLH蛋白氨基酸序列的基本信息，包括氨基酸数量、相对分子量、等电点、疏水性和不稳定性等理化性质。通过在线软件Cell Ploc 2.0进行亚细胞定位预测(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)；
通过在线软件THHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜结构分布和数量的预测。
1.3 生菜bHLH蛋白的保守域序列分析
利用序列分析软件DNAMAN 5.0和在线软件WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)对生菜bHLH蛋白的保守结构域分析。
1.4 生菜bHLH基因基序预测分析
将生菜bHLH家族的蛋白序列提交到在线网站MEME 4.11.4(http://web.mit.edu/meme_v4.11.4/share/doc/overview.html)进行motif预测分析，搜索基序设置为10，基序长度介于6～50之间，导出meme.xml结果文件。将生菜bHLH基因家族每个成员的CDS序列和其对应的基因组序列进行比对，利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线软件进行内含子和外显子图谱的绘制。
1.5 生菜bHLH基因的进化分析
将最终获得的135个生菜bHLH转录因子用ClustalX进行比对，序列比对的结果用MEGA 7.0的NJ法(Neighbor Joining)构建系统发育树，其中检验参数为Bootrap 1000次，模式设置为Poisson model，缺口设置为pair gap deletion。将制作好的进化树导出，利用ITOL网站进行美化和丰富颜色(https://itol.embl.de/)。
2.1 生菜bHLH基因家族成员鉴定
从Pfam数据库中下载bHLH家族的隐马氏模型文件（Pfam码PF00010），搜索生菜的全基因组蛋白数据库，共得到163条bHLH类似基因；
用SMART数据库和hammer网站结构域分析工具鉴定得到的蛋白序列，检查序列缺失、去除冗余，最终获得135条bHLH序列。利用expasy在线程序对生菜bHLH蛋白的理化性质进行分析，bHLH蛋白特性分析表明，最长的bHLH蛋白有685个蛋白质残基，而最短的只有162个蛋白质残基；
它们的等电点分布在0.63～9.51之间，其中有92个酸性蛋白，43个碱性蛋白；
相对分子量在17843.82～75409.15 Da之间；
不稳定指数分布在32.5～76.39之间，其中有123个蛋白的不稳定系数大于40，说明大部分bHLH蛋白为不稳定蛋白；
135个蛋白的疏水性指数均小于0，为亲水性蛋白。cell plot的预测表明有100个蛋白属于细胞核蛋白，是生菜bHLH家族中数目最多的一部分，有16个蛋白定位于叶绿体，有3个蛋白定位于细胞质，有1个蛋白定位于内质网，有1个蛋白定位于细胞膜；
有1个蛋白定位于线粒体。跨膜结构域分析表明，有134个蛋白无跨膜结构域，有1个蛋白有1个跨膜结构域。但目前这些转录因子还未被定位于染色体上。
2.2 生菜bHLH基因保守域的鉴定和分析
使用DNAMAN 5.0对135个生菜bHLH蛋白结构域进行鉴定和分析，并用WebLogo 3获得生菜bHLH蛋白的结构域序列标签。分析发现135个生菜bHLH基因保守域基本由50个氨基酸组成，最长为53个氨基酸，最短为43个氨基酸；
该保守域由N端碱性结构域和C端HLH结构域组成；
其中N端碱性结构域由10～15个氨基酸组成，该区域富含碱性氨基酸精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和酸性氨基酸谷氨酸(E)，谷氨酸可以和DNA的大沟结合。DNAMAN分析表明有103条bHLH序列同时在9位点和12位点同时为E和R，该序列组成可以结合E-Box，有59条bHLH序列同时在5位点、9位点和13位点同时为H、E和R，主要有结合G-Box的功能。C端的HLH结构域的α螺旋富含疏水性氨基酸缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)，其中第23位点的L高度保守，这对维持bHLH蛋白二级结构的稳定有重要作用（图1、图2）。
图1 生菜bHLH结构域的氨基酸序列比对
图2 生菜bHLH转录因子家族的保守结构域
2.3 生菜bHLH转录因子家族进化分析
为了研究生菜bHLH家族成员间的进化关系，利用MEGA7.0对135个蛋白的序列进行进化树分析，结果表明135个bHLH基因被分为10个亚家族（图3），其中第Ⅷ、Ⅳ和Ⅶ亚家族的bHLH蛋白成员最多，分别包含43、27和15个bHLH蛋白；
第Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅱ、Ⅹ亚家族的bHLH蛋白成员为5～10个；
而第Ⅴ亚家族的成员最少，只含有1个bHLH蛋白。
图3 生菜中bHLH蛋白家族的系统进化树
2.4 生菜bHLH蛋白的保守基序确定
为了进一步研究生菜中bHLH蛋白质结构的多样性，通过MEME在线软件对135个bHLH蛋白质进行了保守基序分析，搜索参数设置为50，共获得10条保守基序。由图4可知，135个bHLH蛋白含有2～4个基序，相同家族的bHLH蛋白倾向于有相同的基序，不同的家族间bHLH蛋白基序数量和类型存在差异，推测正是由于这些特异motif的存在导致了bHLH家族基因功能的分化。但不同的家族均包含基础基序motif 1和motif 2，在Inter Pro Scan中这两个基序被注释为Helix-loop-helix DNA-binding domain。在同一家族间内根据motif的差异和基因长度的不同划分为不同的亚家族，一些基序仅存在于特定基因中，这些基序可能有助于形成这些基因的特定功能。其中motif 3特异分布于Ⅷ亚家族，该基序被注释为Basic helix-loophelix leucine zipper transcription factor；
motif 4分布于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅹ六个亚家族；
motif 5特异分布于Ⅱ亚家族；
motif 6特异分布于Ⅷ亚家族；
motif 7分布于Ⅶ和Ⅷ两个亚家族；
motif 8特异分布于Ⅷ亚家族；
motif 9特异分布于Ⅳ亚家族；
motif 10特异分布于Ⅹ亚家族，motif 4-10在Inter Pro Scan中均被注释为未知结构。
2.5 生菜bHLH基因的外显子和内含子结构分析
基因家族各成员的基因结构往往呈现多样性，其中内含子和外显子的数量是基因家族进化过程中的重要标志，本研究根据生菜基因组信息获取了每一个基因的CDS序列信息，并绘制了外显子—内含子基因结构图，结果显示生菜bHLH基因家族内含子数目变化差异较大，介于0～10之间，且内含子的数量在不同的家族间差异较大。由图5可知，生菜bHLH基因家族分为内含子富集和内含子缺失2类，其中XP_023753528.1、XP_023733363.1、XP_023736226.1、XP_023750890.1、XP_023742628.1、PLY63858.1、PLY992 56.1、XP_023753746.1、XP_023751742.1、PLY91151.1、PLY63479.1、 PLY77525.1、 XP_023737733.1、 XP_023748410.1、PLY66263.1无内含子，PLY67254.1、XP_023746624.1、 XP_023736955.1、 XP_023737512.1、PLY62526.1、XP_023748593.1、XP_023735519.1、XP_023756084.1、XP_023750458.1、XP_023762189.1 仅 1个内含子，以上成员均属于内含子缺失组；
PLY86498.1、XP_023767110.1含10个内含子（占比1.5%）；
XP_023754083.1、XP_023759112.1含9个内含子（占比1.5%），PLY73746.1、PLY96464.1含8个内含子（占比 1.5%），XP_023756964.1、XP_023748571.1、XP_023748493.1、 PLY67087.1、 PLY74352.1、 XP_023767039.1、 XP_023771981.1、 PLY62734.1、 XP_023736669.1、 XP_023746595.1、 XP_023751248.1、PLY79054.1含7个内含子（占比8.9%），含6个内含子的bHLH基因18个（占比13.3%），含5个内含子的bHLH基因15个（占比13.3%），以上成员均属内含子富集组。其中含有2个内含子的bHLH基因高达25个，所占成员总数最多，占比18.5%。
图5 生菜bHLH家族基因外显子与内含子基因结构分布
植物bHLH蛋白参与抗逆、生长发育、生物合成及信号传导等生理生化过程[22-23]。目前已从一些植物如拟南芥[8]、水稻[9]、人参[24]、西瓜[25]、茶树[26]、葡萄[27]、苹果[28]等分别鉴定出162、167、169、96、120、110、188个bHLH蛋白，但生菜bHLH家族的研究鲜见报道。本研究基于生菜全基因组数据，利用生物信息学的手段鉴定了生菜bHLH转录因子家族，并且对它们的理化性质、保守结构域、基因结构和系统进化和等情况进行了详细的分析。
通过验证，去除冗余，共鉴定到135个bHLH蛋白。这些bHLH蛋白的蛋白质残基介于162～685之间，它们的等电点分布在0.63～9.51之间，相对分子量在17843.82～75409.15之间；
不稳定指数分布在32.5～76.39之间。这135个蛋白包括100个细胞核蛋白，16个叶绿体蛋白，3个细胞质蛋白，1个内质网蛋白，1个细胞膜蛋白，1个线粒体蛋白；
其中仅有1个蛋白有跨膜结构域。
生菜bHLH蛋白bHLH保守结构域由两部分组成，碱性氨基酸区和HLH区。碱性氨基酸区位于N端，HLH区位于C端[7,29-30]。碱性氨基酸区含有高度保守的His5-Glu9-Arg13序列，第10位和第12位的Arg也高度保守，而HLH区第23位和第55位的Leu高度保守，且保守位点与西瓜[25]、莲[31]和芒果[32]bHLH蛋白的分析结果相似。135个生菜bHLH蛋白中的103个具有E-box的结合功能，59个具有结合G-box的结合功能，该结果与拟南芥(60.54%)和水稻(56.89%)[9]的分析结果相似。
聚类分析表明，135个bHLH蛋白被划分为10个亚家族，共获得10条保守基序。由图可知，135个bHLH蛋白含有2～4个基序，相同家族的bHLH蛋白倾向于有相同的基序，不同的家族间bHLH蛋白基序数量和类型存在差异，推测正是由于这些特异motif的存在导致了bHLH家族基因功能的分化。外显子—内含子基因结构图，结果显示生菜bHLH基因家族内含子数目变化差异较大，介于0～10之间，且内含子的数量在不同的家族间差异较大。
本研究在生菜全基因组中共鉴定出135个bHLH家族蛋白，共发掘出10条保守基序，其中基序motif 1和motif 2是生菜bHLH家族成员均包含的保守基序，为今后生菜bHLH家族蛋白的研究提供了基础。但本研究仅对生菜bHLH蛋白进行了功能预测，其具体功能还需进一步验证。
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