羽扇豆醇调控miR-100-5p对非小细胞肺癌NCI-H1299细胞生物学行为的影响

黄昱刚，谭伶娟，陈广

非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌类型，多数患者在初诊时已发生转移，目前针对NSCLC的化疗药物多存在不良反应和多药耐药。羽扇豆醇是存在于多种蔬菜、水果、药用植物中的五环三萜，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等药理活性［1］。羽扇豆醇对骨肉瘤［2］、乳腺癌［3］、肝癌［4］的影响已被证实。近期研究显示，羽扇豆醇具有抗肺癌转移的作用［5］，还可抑制NSCLC细胞增殖，改变细胞形态，诱导细胞凋亡［6］。然而，羽扇豆醇对NSCLC转移的影响及其机制鲜有报道。微小RNA（miRNA）是短链非编码RNA，其可与靶mRNA结合参与肿瘤细胞的恶性进展过程。在不同类型的癌症中均可以观察到异常表达的miRNAs，这些miRNAs在促进或抑制恶性肿瘤的进展中起着至关重要的作用［7-8］。已发现多种miRNA表达失调参与NSCLC进展［9-10］。NSCLC组织中miR-100-5p表达降低，其可通过靶向成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）抑制NSCLC细胞迁移、侵袭和糖酵解［11］。既往研究显示，药物可通过调控miRNA影响NSCLC细胞发生发展［12］，可见miRNA可作为药物作用的靶点。而miR-100-5p是NSCLC细胞的潜在靶点，由此推测miR-100-5p也可能是羽扇豆醇影响NSCLC细胞恶性进展的作用靶点。本研究旨在探讨羽扇豆醇对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并以miR-100-5p为切入点探讨其在NSCLC进展中的调控机制。

1.1 材料 miR-100-5p模拟物（miR-100-5p mimic，5′-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3′）及 其 阴 性 对 照miRNC（5′-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3′）、miR-100-5p抑 制 物（anti-miR-100-5p，5′-CACAAGUUCGGAUCUAC⁃GGGUU-3′）及其阴性对照anti-miR-NC（5′-CAGUACUUUU⁃GUGUAGUACAA-3′）购自广州锐博生物公司。人NSCLC细胞NCI-H1299、胎牛血清（FBS）、青/链霉素混合液（P/S）、RPMI-1640培养液（武汉普诺赛生物公司）；
Lipofectamine 2000购自Invitrogen；
羽扇豆醇（货号B21602，纯度大于98%，上海源叶生物公司）；
CCK-8试剂盒、ECL发光液、RIPA缓冲液（北京索莱宝生物公司）；
miRNA cDNA合成试剂盒、SYBR Premix Ex Taq、TRIzol试剂（大连Takara公司）；
兔单克隆抗体细胞周期蛋白D1（CyclinD1，货号bs-20596R）、MMP2（货号bs-0412R）和MMP9（货号bs-4593R）、β-actin（货号bs-0061R）及辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗（货号bs-0295P-HRP）购自北京博奥森生物公司。Transwell小室（货号3450）购自科站生物科技有限公司；
实时荧光定量PCR仪MA-6000购自山东高芯生物传感器研究院有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 NCI-H1299细胞接种于含10%FBS、1%P/S的RPMI-1640培养基，置于37℃，含95%空气、5%CO2培养箱孵育。细胞80%融合时，加入胰蛋白酶消化，1∶4传代。每周换液2~3次。将对数生长期NCI-H1299细胞以2×104个/孔接种于24孔板中，用含0、12.5、25、50μmol/L羽扇豆醇［4］的培养液孵育NCI-H1299细胞48 h，分别记为正常对照（NC）组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。使用Lipofectamine 2000将miR-NC、miR-100-5p mimic转染细胞，记为miR-NC组、miR-100-5p组；
细胞转染anti-miR-NC、anti-miR-100-5p后用含50μmol/L羽扇豆醇培养，记为anti-miR-NC+高剂量组、anti-miR-100-5p+高剂量组。每组3个复孔。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力 将各组细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，按照实验分组分别给予对应浓度的羽扇豆醇处理48 h。更换为100μL新鲜培养液，加入10μL CCK-8试剂，继续孵育2 h。酶标仪检测450 nm处光密度（OD）值。

1.2.3 克隆形成实验检测细胞增殖能力 胰酶消化各组NCI-H1299，按照5×102个/孔接种于6孔板中，轻旋平板使细胞均匀分散，于37℃培养箱孵育，直至出现细胞集落。弃去培养液，PBS冲洗2次，4%多聚甲醛固定后，用1%结晶紫染色。显微镜下拍照计数大于50个细胞的集落数。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 胰酶消化各组NCI-H1299细胞，用无血清培养基调整为1×106个/mL单细胞悬液。向Transwell上室、24孔板下室分别加入100μL细胞悬液、500μL含血清培养基。于37℃孵育24 h后，用湿棉签去除Transwell上室残留细胞，用4%多聚甲醛固定穿膜细胞，1%结晶紫染色。显微镜下随机读取3个视野计数，取其均值作为细胞迁移数。侵袭测定时采用包被基质胶的小室，其余步骤和迁移测定一致。

1.2.5 qPCR检测miR-100-5p表达 采用TRIzol试剂从NCI-H1299细胞中分离总RNA。用miRNA cDNA合成试剂盒进行逆转录，再以其产物为模板用SYBR Premix Ex Taq进行荧光定量PCR（qPCR）。miR-100-5p和U6的引物序列由广州锐博生物公司合成。miR-100-5p引物序列：上游5′-GAACCCGTAGATCCGAACT-3′，下 游5′-CAGTGCGTGTC⁃GTGGAGT-3′，产物大小168 bp；
U6引物序列：上游5′-CTC⁃GCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGC⁃GT-3′，产物大小185 bp。扩增条件为95℃10 min；
95℃10 s，60℃30 s，40次循环。miR-100-5p表达值以U6为内参基因，用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.2.6 Western blot检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表达 RIPA缓冲液裂解各组NCI-H1299细胞，收集蛋白-80℃暂时保存。蛋白定量后，等量的蛋白通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。在25℃下5%脱脂奶粉封闭1 h；
在4℃下用CyclinD1、MMP2、MMP9和β-actin一抗（均1∶2 000稀释）孵育过夜；
第2天，在25℃下用二抗孵育1 h。将ECL发光液滴加至膜正面，暗室显色5 min。显影、定影。用Image J软件定量蛋白表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量数据以表示，2组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 羽扇豆醇对NCI-H1299细胞活力、增殖及CyclinD1蛋白表达的影响 与NC组比较，低、中、高剂量组NCI-H1299细胞CyclinD1蛋白表达、细胞活力、细胞克隆数逐渐降低，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图1、2，表1。

Fig.1 Effects of lupeol on NCI-H1299 cell clone图1 羽扇豆醇对NCI-H1299细胞克隆的影响

Fig.2 The expression of CyclinD1 protein detected by Western blot assay图2 Western blot检测CyclinD1蛋白的表达

2.2 羽扇豆醇对NCI-H1299迁移和侵袭及MMP2、MMP9蛋白表达的影响 与NC组比较，低、中、高剂量组NCI-H1299细胞迁移数、侵袭数、MMP2和MMP9蛋白表达逐渐降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3、4，表2。

Tab.1 Comparison of proliferation and expression level of CyclinD1 protein in NCI-H1299 cells between four groups表1 各组NCI-H1299细胞增殖和CyclinD1蛋白表达水平比较 （n=9）

Tab.1 Comparison of proliferation and expression level of CyclinD1 protein in NCI-H1299 cells between four groups表1 各组NCI-H1299细胞增殖和CyclinD1蛋白表达水平比较 （n=9）

＊＊P＜0.01；
a与NC组比较，b与低剂量组比较，c与中剂量组比较，P＜0.05。

组别NC组低剂量组中剂量组高剂量组F OD450 1.01±0.10 0.90±0.09a 0.73±0.07ab 0.51±0.05abc 67.047＊＊细胞克隆数（个）113.00±8.26 84.00±7.15a 61.00±5.13ab 50.00±4.02abc 172.777＊＊CyclinD1 0.85±0.09 0.73±0.07a 0.53±0.05ab 0.41±0.04abc 81.965＊＊

Fig.4 Expressions of MMP2 and MMP9 proteins detected by Western blot assay图4 Western blot检测MMP2和MMP9蛋白的表达

Tab.2 Comparison of migration and invasion of NCIH1299 cells and the expression levels of MMP2 and MMP9 proteins between four groups表2各组NCI-H1299细胞迁移、侵袭及MMP2、MMP9蛋白表达水平比较 （n=9，）

Tab.2 Comparison of migration and invasion of NCIH1299 cells and the expression levels of MMP2 and MMP9 proteins between four groups表2各组NCI-H1299细胞迁移、侵袭及MMP2、MMP9蛋白表达水平比较 （n=9，）

＊＊P＜0.01；
a与NC组比较，b与低剂量组比较，c与中剂量组比较，P＜0.05。

组别NC组低剂量组中剂量组高剂量组F细胞迁移数（个）154.00±12.25 127.00±10.13a 100.00±9.24ab 62.00±5.16abc 152.245＊＊细胞侵袭数（个）136.00±13.32 101.00±10.03a 88.00±8.02ab 51.00±4.01abc 123.809＊＊MMP2 0.83±0.08 0.70±0.07a 0.57±0.05ab 0.42±0.04abc 72.156＊＊MMP9 0.75±0.06 0.62±0.06a 0.48±0.04ab 0.37±0.03abc 101.567＊＊

Fig.3 Effects of lupeol on migration and invasion of NCI-H1299 cells detected by Transwell assay图3 Transwell检测羽扇豆醇对NCI-H1299细胞迁移、侵袭的影响

2.3 羽扇豆醇对miR-100-5p基因表达的影响 与NC组（1.00±0.09）比较，低（1.36±0.11）、中（1.83±0.15）、高（2.31±0.21）剂量组NCI-H1299细胞miR-100-5p表达水平逐渐升高，差异均有统计学意义（F=134.392，P＜0.05）。

2.4 过表达miR-100-5p对NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达的影响 与miR-NC组比较，miR-100-5p组NCI-H1299细胞中miR-100-5p表达水平增加，细胞活力降低，细胞克隆数、迁移数、侵袭数减少，CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达降低（P＜0.05），见图5~7，表3。

Fig.5 Effects of miR-100-5p on NCI-H1299 cell clone图5 miR-100-5p对NCI-H1299细胞克隆的影响

Fig.6 Effects of miR-100-5p on migration and invasion of NCIH1299 cells detected by Transwell assay图6 Transwell检测miR-100-5p对NCI-H1299细胞迁移、侵袭的影响

2.5 抑制miR-100-5p表达可逆转羽扇豆醇对NCIH1299细胞增殖、迁移和侵袭及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达的影响 与anti-miR-NC+高剂量组比较，anti-miR-100-5p+高剂量组NCI-H1299细胞miR-100-5p表达水平降低，细胞活力升高，细胞克隆数、迁移数、侵袭数增多，CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达增加（P＜0.05），见图8~10，表4。

Fig.7 Expression of CyclinD1,MMP2 and MMP9 proteins detected by Western blot assay图7 Western blot检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表达

Fig.8 Inhibition of miR-100-5p expression reversed the effect of lupeol on NCI-H1299 cell clone图8 抑制miR-100-5p表达可逆转羽扇豆醇对NCI-H1299细胞克隆的影响

Fig.9 Effects of inhibition of miR-100-5p expression on migration and invasion of NCI-H1299 cells after lupeol intervention detected by Transwell图9 Transwell检测抑制miR-100-5p表达对羽扇豆醇干预后NCI-H1299细胞迁移、侵袭的影响

Tab.3 Comparison of proliferation,migration,invasion and the expression levels of CyclinD1,MMP2 and MMP9 proteins in NCI-H1299 cells between two groups after overexpression of miR-100-5p表3 过表达miR-100-5p后2组NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平比较（n=9，）

Tab.3 Comparison of proliferation,migration,invasion and the expression levels of CyclinD1,MMP2 and MMP9 proteins in NCI-H1299 cells between two groups after overexpression of miR-100-5p表3 过表达miR-100-5p后2组NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平比较（n=9，）

＊＊P＜0.01。

组别miR-NC组miR-100-5p组t miR-100-5p 1.01±0.11 2.68±0.34 14.020＊＊OD值1.09±0.08 0.69±0.08 10.607＊＊细胞克隆数（个）109.00±11.21 56.00±4.12 13.313＊＊细胞迁移数（个）152.00±13.01 85.00±6.33 13.893＊＊细胞侵袭数（个）145.00±13.12 68.00±5.11 16.406＊＊CyclinD1 0.79±0.04 0.52±0.06 11.233＊＊MMP2 0.82±0.07 0.56±0.07 7.879＊＊MMP9 0.72±0.08 0.45±0.06 8.100＊＊

Tab.4 Comparison of proliferation,migration and invasion of NCI-H1299 cells and the expression levels of CyclinD1,MMP2,MMP9 proteins between two groups after inhibition of miR-100-5p表4 抑制miR-100-5p表达后2组NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平比较（n=9，）

Tab.4 Comparison of proliferation,migration and invasion of NCI-H1299 cells and the expression levels of CyclinD1,MMP2,MMP9 proteins between two groups after inhibition of miR-100-5p表4 抑制miR-100-5p表达后2组NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平比较（n=9，）

＊＊P＜0.01。

组别anti-miR-NC+高剂量组anti-miR-100-5p+高剂量组t miR-100-5p 1.00±0.09 0.45±0.04 16.753＊＊OD值0.58±0.05 1.12±0.10 14.490＊＊细胞克隆数（个）64.00±5.34 132.00±9.14 19.271＊＊细胞迁移数（个）47.00±4.34 77.00±6.54 11.466＊＊细胞侵袭数（个）44.00±3.83 70.00±5.28 11.958＊＊CyclinD1 0.42±0.04 0.87±0.07 16.745＊＊MMP2 0.40±0.03 0.82±0.07 16.545＊＊MMP9 0.35±0.03 0.76±0.07 16.151＊＊

Fig.10 Expression of CyclinD1,MMP2 and MMP9 proteins detected by Western blot Assay图10 Western blot检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表达

植物来源化合物可通过诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制细胞增殖等途径发挥抗肿瘤活性，是潜在的抗肿瘤药物。研究证实羽扇豆醇通过诱导S期周期阻滞和细胞凋亡来抑制宫颈癌细胞生长［13］。羽扇豆醇还可增强沉默ST3GalⅢ对乳腺癌细胞侵袭转移的抑制作用［14］。本研究表明，羽扇豆醇以剂量依赖方式降低NCI-H1299细胞活力，抑制其克隆形成，这表明羽扇豆醇可抑制NSCLC细胞增殖。CyclinD1与细胞增殖相关，其通过激活G1期特有的细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4），推动细胞由G1期进入S期，进而促进增殖。本研究发现羽扇豆醇干预后NCI-H1299细胞中的CyclinD1蛋白水平明显下调，与CCK-8和克隆形成实验的结果一致，说明羽扇豆醇可能通过抑制CyclinD1表达阻滞细胞周期进展从而抑制增殖。MMP2和MMP9是MMP家族中被广泛研究的成员，其在肺癌的侵袭和转移中起主导作用［15］。MMP2和MMP9上调，细胞迁移和侵袭能力增强。羽扇豆醇以剂量依赖方式下调NCI-H1299细胞中MMP2、MMP9表达水平，影响细胞外基质降解，进而抑制NCI-H1299细胞迁移和侵袭能力。

miRNA作为生物标志物和治疗靶点在癌症研究中引起了广泛关注，其通过调节CyclinD1、MMP2和MMP9表达影响肿瘤增殖和迁移、侵袭［16-17］。另有研究表明miRNA还可能是植物来源化合物抗肿瘤的潜在靶标［18］。Zhong等［2］发现羽扇豆醇通过上调miR-212-3p的表达来抑制骨肉瘤细胞活力和侵袭。张小鹰等［19］证实羽扇豆醇可增强miR-145-5p对前列腺癌细胞的抗增殖和促凋亡作用。以上研究证实miRNA可作为羽扇豆醇抗肿瘤进展的靶点。miR-100-5p的抑瘤功能已有多项研究报道，miR-100-5p在脊索瘤组织中表达下调，过表达miR-100-5p在体内外均能抑制脊索瘤的生长，并通过抑制上皮-间充质转化进而抑制脊索瘤细胞的迁移和侵袭［20］；
miR-100-5p可下调mTOR基因表达进而抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力［21］。本研究显示，随着羽扇豆醇浓度的增加，NCI-H1299细胞miR-100-5p表达水平显著上调，提示miR-100-5p表达升高可能介导羽扇豆醇的抗癌作用。过表达miR-100-5p抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭，并降低CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达，说明miR-100-5p通过下调相关蛋白表达抑制细胞的增殖和转移。本研究发现，在羽扇豆醇处理的基础上抑制miR-100-5p表达，细胞增殖、迁移及侵袭能力增强，CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白上调，提示抑制miR-100-5p表达可部分减弱羽扇豆醇对NCI-H1299细胞的抑制作用，进一步表明羽扇豆醇通过上调miR-100-5p表达抑制NSCLC细胞恶性生物学行为。

综上所述，羽扇豆醇具有抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭活力，其机制可能是通过上调miR-100-5p实现的。本研究初步揭示了羽扇豆醇的抗NSCLC机制，为羽扇豆醇用于防治NSCLC提供了依据。由于本研究仅为细胞水平研究，未进行动物模型实验，故有待后续通过体内实验验证本研究结果，为羽扇豆醇用于临床治疗NSCLC奠定基础。

猜你喜欢 货号孵育克隆 克隆狼环球时报(2022-09-20)2022-09-20鞋品牌新品爆单“故事汇”服饰导报·鞋世界(2021年4期)2021-05-17浙江：诞生首批体细胞克隆猪今日农业(2020年24期)2020-12-15优化后精液孵育时间对精子DNA完整性、顶体反应率及IUI临床结局的影响江西医药(2020年4期)2020-04-28作者更正致歉说明中国药理学通报(2019年5期)2019-01-11三物黄芩汤组分(群)配伍在大鼠肝微粒体孵育模型中的相互作用中成药(2017年9期)2017-12-19大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的测定及其代谢中成药(2017年5期)2017-06-13应用快速孵育法优化酶联免疫吸附实验过程探讨——以乙型肝炎病毒表面抗原检测为例标记免疫分析与临床(2016年9期)2016-11-21属于“我们”小资CHIC！ELEGANCE(2015年15期)2015-09-01Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定现代检验医学杂志(2015年4期)2015-02-06