黄芪提取物对DR模型大鼠眼部血流动力学的干预效果及对血清IL-6和VEGF水平的影响
时间：2023-03-11 14:40:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
仪立群 王淼 林琳 仲苏鄂 王庆海
(三峡大学第二人民医院眼科，湖北 宜昌 443000)
糖尿病(DM)患者人数在我国截止到2010年以达到九千余万，每年呈上升趋势。DM属于慢性全身疾病，2型糖尿病(T2DM)患者占DM患者人数的95%，患者的身体健康及生存质量已经严重受到威胁〔1〕。糖尿病视网膜病变(DR)属于一种慢性低度炎症病变，是由DM引起的视网膜血管病变，导致DM患者丧失视力的主要原因〔2〕。有学者研究表示，DR严重的可导致患者失明，视网膜微血管系统损伤是由于糖代谢紊乱，导致视网膜血管周细胞凋亡、血管舒缩调节功能失常及血管基底膜增厚等〔3〕。DR患者在早期并无明显症状，由于长期病变累积则会出现黄斑水肿、眼底出血、异常微血管瘤等，最终视力下降，严重者甚至失明〔4〕。本研究黄芪提取物对DR模型大鼠的干预效果及对白细胞介素(IL)-6、血管内皮生长因子(VEGF)水平的影响。
1.1材料 研究动物：选取50只健康雄性SD大鼠，8～12个月，平均(10.6±1.2)个月，体重350～480 g，平均(420.6±20.4)g。由北京科奥协力饲料有限公司提供，合格证号：京动(2000)第015号，所有大鼠放于无病原菌的干净笼子里喂养，饲养温度维持在(23.0±1.6)℃，饮用水和食物均进行高温及高压消毒。本研究获医院伦理委员会批准。
主要药物及主要仪器：黄芪(甘肃野生黄芪)，链脲佐菌素(STZ，上海颖心实验设备有限公司)，免疫比浊法试剂盒(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)，酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司)，血糖检测仪(德国罗氏)，兔抗大鼠IL-6、VEGF抗体(Sigma公司)，小鼠抗大鼠总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)抗体(Dako公司)，兔抗小鼠低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)抗体(Gibco 公司)。电子天平、pH计(上海京孚仪器有限公司)；
蛋白垂直电泳仪(北京六一仪器厂)；
微量移液器(广州雷得生物技术有限公司)；
超纯水仪(中天光学仪器有限责任公司)；
磁力搅拌器(其林贝尔仪器制造有限公司)；
多功能酶标仪(Bio-rad公司)；
离心机(Sigma公司)；
-80℃冰箱(日本三洋公司)；
紫外分光光度计(莫赛飞公司)；
恒温水浴箱(上海一凯仪器设备有限公司)。
1.2方法
1.2.1黄芪提取物制作 称取黄芪片20 g，加入100 ml蒸馏水，冷浸过夜后，进行加热煮沸30 min,倒出清液，使用小火进行浓缩到10 ml，制成含生药2 g/ml的药液，使用滤纸将凉后的药液过滤，使用一次性针头滤器过滤，分装灭菌放入安瓿瓶后放入冰箱备用。
1.2.2DR模型建立 选取40只大鼠制作模型，参考杨钦钦等〔5〕研究实验中DR大鼠模型的建立方法并进行适当改动，建立DR模型，均以高脂饲料喂养6 w后禁止饮食饮水12 h，建立DR大鼠模型使用STZ 60 mg/kg进行腹腔注射。3 d后取大鼠尾尖血，测血糖≥16.7 mmol/L则DM大鼠造模成功。将DM大鼠继续进行高脂饲料饲养1个月后以普通饲料喂养，DM大鼠眼底有明显视网膜出血及渗出者为DR大鼠建模成功。
1.2.3用药及分组 将建模成功的40只大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，各组10只。低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠分别使用40、60、80 mg/kg黄芪提取物溶液进行灌胃处理，1次/d，连续干预2 w。正常组及模型组给予同等体积的无菌生理盐水灌胃治疗。治疗期间大鼠均自由饮食。
1.2.4视网膜组织观察 使用10%水合氯醛对大鼠进行麻醉处理后处死，解剖快速取出新鲜大鼠双眼视网膜，放置于甲醛溶液中，固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋，间距5 μm做连续切片。将切片烤干后进行脱蜡处理，之后顺序置入100%、95%、80%、75%浓度的酒精中各复水3 min。使用苏木素染色15 min后清洗3次，使用盐酸-酒精分化处理30 s，再次清洗两次，使用1%氨水泛蓝，充分清洗之后使用1%伊红染色，使用酒精进行脱水处理后进行脱蜡处理，封片后使用显微镜进行观察。
1.2.5血脂检测 采取禁食12 h后的大鼠腹静脉抽取静脉血液3 ml，离心后取血清，采用CHOD-PAP法检测TC水平，GPO-PAP法检测TG水平，检测过程分别按照总胆固醇单试剂测定试剂盒、TG检测试剂盒操作说明书进行。采用直接法-过氧化物酶清除法检测LDL-C、HDL-C。酶标仪预热0.5 h，波长调节至240 nm，将检测工作液37℃反应5 min，提取已采集的血清样本，加入190 μl工作液，在酶标仪上振动5 s开始计时，记录240 nm下初始吸光值A1和1 min后的吸光值A2。计算公式A=A1-A2。
1.2.6IL-6、VEGF 取各组大鼠血清标本，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6、VEGF水平：对抗原进行稀释后将其加入聚苯乙烯的反应孔中，加盖处理后，在温度4℃的条件下放置24 h，次日洗涤3次后，抛干，在每孔中均加入稀释液(pH值为7.4 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液)稀释的待测标本0.1 ml，并加入阳性和阴性对照标本，在温度为42℃的条件下放置60 min，将液体移除并洗涤3次后，抛干，在每孔中加入IL-6、VEGF抗体0.1 ml，再次放置60 min，将液体移除并洗涤3次，抛干，并在每孔中加入底物液〔0.1 mol/L的磷酸氢二钠(Na2HPO4),0.05 mol/L的枸橼酸〕混匀，且加入0.1 ml邻苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L硫酸 (H2SO4) 0.05 ml放置各孔内，终止反应。使用酶标仪检测A450值，分析IL-6、VEGF水平。
1.2.7空腹血糖检测 大鼠进行麻醉处死前，使用血糖监测仪对血糖进行检测，并进行组间比较。
1.2.8视网膜中央动脉(CRA)血流动力学变化检测 实验大鼠在最后一次给药前1 d对大鼠右眼进行彩色多普勒检查，检测每次大鼠右眼CRA的血流动力学指标收缩期峰值血流速度(Max)、舒张末期流速(Min)、平均血流速度(TAMx)。
1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验。
2.1DR模型建立前后大鼠图片 正常大鼠晶状体透明，无异常病变现象；
DR模型大鼠晶状体组织较为混浊。见图1。
图1 DR模型建立前后大鼠
2.25组大鼠病理形态学观察 正常组大鼠视网膜结构完整，内外颗粒层细胞排列规则、紧密，无异常现象。模型组与正常组比较，视网膜内外颗粒层细胞排列杂乱且较为稀疏、肿胀，伴有空泡样变化；
与模型组相比，低剂量组，中剂量组，高剂量组视网膜内外颗粒层细胞充血、肿胀情况缓解，内膜光滑程度上升，细胞排列杂乱情况出现缓解。与低剂量组、中剂量组相比，高剂量组内膜较为光滑，内外颗粒层细胞排列最为紧密，细胞充血、肿胀情况基本消失。见图2。
2.35组血脂水平及空腹血糖比较 模型组TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明显高于正常组，HDL-C水平明显低于正常组(P<0.05，P<0.001)；
低剂量组、中剂量组、高剂量组TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明显高于正常组，明显低于模型组，HDL-C明显低于正常组，明显高于模型组(均P<0.001)；
高剂量组TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明显低于低剂量组，中剂量组，HDL-C明显高于低剂量组、中剂量组(均P<0.001)。见表1。
图2 5组病理学形态观察(HE染色，×400)
表1 5组血脂水平、空腹血糖水平比较
2.45组IL-6、VEGF水平及CRA血流动力变化 模型组Max、Min、TAMx水平明显低于正常组，IL-6、VEGF明显高于正常组(均P<0.001)；
低剂量组、中剂量组、高剂量组Max、Min、TAMx水平明显低于正常组，明显高于模型组；
IL-6、VEGF水平明显高于正常组，明显低于模型组(均P<0.001)；
高剂量组Max、Min、TAMx水平明显高于低剂量组、中剂量组，高剂量组IL-6、VEGF水平明显低于低剂量组、中剂量组(均P<0.001)。见表2。
表2 5组CRA血流动力学及IL-6、VEGF变化
DR属于DM最常见的并发症，视网膜血管屏障的破坏、血管通透性增加、视网膜局部缺氧等病理现象均有多种炎性因子参与〔6〕。视网膜微血管循环功能异常开始在DR最早时期，视网膜微血管循环功能异常主要表现是血液流变学和血流动力学〔7〕。DR的病理特征主要有视网膜新生血管形成和血-视网膜屏障破坏〔8〕。
黄芪主要成分包括黄芪总黄酮、黄芪总皂苷、黄芪总多糖及各种氨基酸和微量元素等〔9〕。主要药理作用有利尿降压、抗炎镇痛，抗氧自由基生成及提高免疫功能〔10〕。有学者研究表示，DM患者及并发症使用黄芪治疗有一定的疗效，可以改善学流动力学，使血糖降低，保护血管内皮细胞的同时还可以抑制微血管病变的功能〔11〕。有学者研究发现，患者高糖状态下产生的大量活性氧可以被黄芪甲苷有效清除，并且可以在调节足细胞凋亡相关蛋白的表达后，来抑制足细胞凋亡〔12〕。
本研究显示，DR大鼠视网膜组织细胞排列出现杂乱、稀疏现象，视网膜内外颗粒层细胞出现肿胀、空泡样变化，使用黄芪提取物进行干预的DR大鼠膜组织细胞排列杂乱、稀疏、内外颗粒层细胞肿胀、空泡样变化明显缓解，出现这一研究结果原因可能是使用黄芪提取物进行干预能够调节DR大鼠血糖、血脂水平，从而发挥干预效果。黄芪干燥根中提取的大分子多糖成分属于黄芪多糖，抵抗自由基损伤，可以清除氧自由基，降低脂质过氧化，调节免疫功能、抗衰老等多种功效〔13〕。有学者研究发现，黄芪多糖可以调节血脂，降低正常人群血液中的TC、TG、LDL-C水平〔14〕。本研究说明，使用黄芪提取物可以有效调控血脂指标水平，从而对DR大鼠起到干预效果。
有学者研究发现，在DM慢性炎症反应中，多种炎性因子逐渐受到重视，IL-6在DM中存在独立危险因素，在急性相反应中属于始发因子和主要物质，胰岛素与其相互作用〔15〕。研究显示，增加到一定程度上的IL-6，可以抑制胰岛素分泌，进而损伤β细胞，导致DM的加重〔16,17〕。VEGF在DR患者中属于一种可溶性血管因子，由视网膜缺血产生，不仅可以使血管再生，还可以增加血管的通透性，在患者视网膜缺血状态下，VEGF会异常高表达，从而促进患者视网膜新生血管生长，加重患者病情〔18,19〕。本研究结果说明，黄芪提取物能够调控IL-6、VEGF及血糖水平，改善血糖及眼底视网膜环境，从而治疗DR大鼠。
CRA是眼动脉终末分支，反映视网膜学流动力学改变可以通过监控患者血流流速，血液流变学改变主要体现在红细胞凝集性增高、变形能力下降和血液黏度增高，视网膜学流动力学变化监测可以检测以上相关指标〔20〕。本研究结果说明，黄芪提取物能够调控Max、Min、TAMx水平，改善动态实时眼部血管学流动力学水平，从而发挥干预效果。
综上，黄芪提取物能够调控血脂紊乱，改善血糖及眼底血液供应，从而治疗DR大鼠，为临床治疗DR提供理论依据。
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