HPLC,法同时测定玉屏风口服液中12,种成分及质量一致性评价
时间：2023-03-11 11:30:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
岳 超徐普刘柱施贝 张文婷王峰
（浙江省食品药品检验研究院， 浙江 杭州310052）
玉屏风为中医扶正固表的经典名方，具有益气、固表、止汗功效，主要用于表虚不固、自汗恶风、面色晄白或体虚易感风邪者，在新冠肺炎治疗中作为推荐预防用药，目前对该方成分的研究主要涉及皂苷类化合物，剂型大多为颗粒剂［1⁃4］、汤剂、散剂［3⁃10］。玉 屏风口服液收载于2020年版《中国药典》中，大多以单一成分为质量控制指标，但该制剂制备工艺复杂，故上述标准无法准确评价其质量一致性。
本实验以玉屏风口服液为研究对象，考察含量高、易提取并具有调节免疫力、解热、抗炎、镇痛等作用［11⁃18］的成分，最终选取黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、槲皮素、毛蕊异黄酮，防风中的麻素苷、升麻素、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇苷、芒柄花素，白术中的白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及苍术酮，建立HPLC 法同时测定其含量，并考察17 批样品的质量一致性，以期为更全面合理地评价和控制该制剂质量提供参考依据。
1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置G1314F 型DAD 检测器、G316A 型柱温箱、G376E型自动进样器、G312B 型二元泵（美国Agilent 公司）；
电子分析天平（万分之一，瑞士梅特勒⁃托利多公司）；
KH5200DE 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；
高速离心机（美国赛默飞世尔科技公司）。
1.2 试剂与药物 升麻素苷（纯度96.2%，批号111522⁃201712）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（纯度97.6%，批 号111920⁃201606）、升麻素（纯度100%，批号111710⁃200602）、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇（纯度97.4%，批号111523⁃20181）、亥茅酚苷（纯度100%，批号111714⁃200501）、槲皮素（纯度98.1%，批 号100081⁃201509）、白术内酯Ⅰ（纯度99.9%，批号111975⁃201501）、白术内酯Ⅱ（纯度99.9%，批号111976⁃201501）、白术内酯Ⅲ（纯度99.9%，批号111978⁃201501）、苍术酮（纯度98.0%，批号DST90607⁃107）对照品（中国食品药品检定研究院）；
毛蕊异黄酮对照品（纯度100%，成都普思生物科技股份有限公司，批号PS010251）；
芒柄花素对照品（纯度98.0%，成都德思特生物技术有限公司，批号DST91202⁃011）。黄芪（膜荚）（批号121462⁃201304）、黄芪（蒙古）（批号120974⁃201612）、防风（批号120947⁃201409）、白术（炒）（批号120925⁃201611）对照药材（中国食品药品检定研究院）。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；
甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；
水为纯化水。玉屏风口服液共17批，均购于线下或线上药店，具体信息见表1。
表1 样品信息Tab.1 Information of samples
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇稀释成含升麻素苷1 067 μg／mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷1 019 μg／mL、升麻素1 246 μg／mL、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇1 151 μg／mL、亥茅酚苷1 344 μg／mL、毛蕊异黄酮1 167 μg／mL、芒柄花素1 205 μg／mL、槲皮素1 185 μg／mL、白术内酯Ⅰ355 μg／mL、白术内酯Ⅱ350 μg／mL、白术内酯Ⅲ371 μg／mL、苍术酮506 μg／mL 的溶液，分别吸取适量至同一量瓶中，甲醇稀释，即得（各成分质量浓度范围为35.01～67.20 μg／mL）。
2.1.2 供试品溶液 精密吸取本品1.0 mL 至20 mL量瓶中，80%甲醇定容至刻度，摇匀，静置，取上清液，0.45 μm 有机滤膜过滤，即得。
2.1.3 阴性样品溶液 分别制备缺黄芪、缺防风、缺炒白术的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。
2.2 色谱条件 Waters SunFire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相水（A）⁃乙腈（B），梯度洗脱（0～32 min，9%～35% B；
32～60 min，35%～80%B；
60～65 min，80%～90%B；
65～70 min，90% B；
70～73 min，90%～9% B；
73～75 min，9%B）；
体积流量1.0 mL／min；
柱温35 ℃；
检测波长300 nm（0～47 min，升麻素苷、升麻素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇、毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、槲皮素、芒柄花素）、220 nm（47～54 min，白术内酯Ⅲ）、275 nm（54～58 min，白术内酯Ⅱ）、220 nm（58～75 min，白术内酯Ⅰ、苍术酮）；
进样量10 μL。
2.3 系统适应性考察与专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分均达到基线分离，分离度均大于1.5，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。
图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constitents
2.4 线性关系考察 分别精密吸取不同体积对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，再将对照品溶液逐级稀释，以信噪比（S／N）为3 时对应的质量浓度为检出限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。
表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents
2.5 精密度、稳定性、重复性试验
2.5.1 精密度 吸取同一份对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得各成分峰面积RSD 分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.12%、亥茅酚苷0.24%、槲皮素0.09%、毛蕊异黄酮0.52%、升麻素苷0.32%、升麻素0.55%、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇苷0.73%、芒柄花素0.48%、白术内酯Ⅰ1.41%、白术内酯Ⅱ1.24%、白术内酯Ⅲ1.06%、苍术酮0.82%，表明仪器精密度良好。
2.5.2 稳定性 取同一份供试品溶液，于0、6、12、20、30、40、50 h 在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得各成分含量RSD 分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.33%、亥茅酚苷0.42%、槲皮素1.02%、毛蕊异黄酮0.84%、麻素苷1.07%、升麻素0.94%、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇苷0.73%、芒柄花素0.84%、白术内酯Ⅰ1.11%、白术内酯Ⅱ1.13%、白术内酯Ⅲ0.94%、苍术酮0.65%，表明溶液在50 h 内稳定性良好。
2.5.3 重复性 取同一批本品（编号YP⁃8），按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得各成分含量RSD 分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.59%、亥茅酚苷0.75%、槲皮素0.73%、毛蕊异黄酮0.94%、麻素苷1.26%、升麻素0.96%、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇苷0.93%、芒柄花素0.97%、白术内酯Ⅰ0.76%、白术内酯Ⅱ1.34%、白术内酯Ⅲ1.29%、苍术酮0.73%，表明该方法重复性良好。
2.6 加样回收率试验 取9 份各成分含量已知的本品（编号YP⁃8），每份0.50 mL，分别加入0.10、0.20、0.30 mL 对照品溶液各3份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，各成分平均加样回收率（RSD）分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷97.6%（2.45%）、亥茅酚苷95.3%（2.87%）、槲皮素 94.7%（1.18%）、毛蕊异黄酮 97.6%（1.04%）、升麻素苷97.1%（1.60%）、升麻素97.1%（1.60%）、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇苷100.7%（1.73%）、芒柄花素96.3%（1.99%）、白术内酯Ⅰ95.8%（2.56%）、白术内酯 Ⅱ 95.3%（2.79%）、白术内酯Ⅲ96.6%（3.07%）。
2.7 样品含量测定 取17 批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。由此可知，升麻素苷、毛蕊异黄酮苷、5⁃O⁃甲基维斯阿米醇苷、毛蕊异黄酮含量较高；
不同厂家、批次样品中各成分含量之间差异较大，如YP3 与YP7，并且相同厂家不同批次样品亦然，如YP4 与YP16；
所有批次样品中均未检出白术内酯Ⅰ。
表3 各成分含量测定结果（mg／mL）Tab.3 Results of content determination of various constituents
2.8 化学模式识别
2.8.1 主成分分析 以表3 数据为变量，采用SPSS 22.0 软件进行主成分分析，计算相关系数的特征值和方差贡献率，提取特征值＞1者，总方差贡献率见表4，主成分图分析见图2，特征值载荷图见图3。由此可知，前4 个主成分特征值均＞1，方差累积贡献率达94.436%；
样品YP6、YP11、YP16 距离原点较远，可明显与其他样品区分开；
与原始变量关系最密切的目标物为芒柄花素、升麻素、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮，来自黄芪、防风药材，对主成分的贡献较大。
表4 主成分特征值的总方差贡献率Tab.4 Total variance contribution rates of characteristic values for principal components
图2 17 批样品主成分分析图Fig.2 Principal component analysis diagram for seventeen batches of simples
2.8.2 聚类分析 以表3 数据为变量，采用SPSS 22.0 软件中的组间联接系统聚类法，以平方欧式距离为测度进行聚类分析，结果见图4。由此可知，17 批样品聚为4类，YP3、YP8 为一类，YP6为一类，YP11、YP16 为一类，其余样品为一类，与图3 一致；
YP3、YP8，YP11、YP16 中各成分含量占比相似，总和最高，与表3 一致，表示模型稳定可靠。
图3 主成分特征值载荷图Fig.3 Loading diagram for characteristic values of principal components
图4 17 批样品聚类树状图Fig.4 Cluster dendrogram of seventeen batches of samples
3.1 测定方法优化 本实验分别考察了不同稀释溶剂（甲醇、乙醇、水、乙腈、80%甲醇、50%甲醇），发现80%甲醇稀释时杂质干扰少，各成分含量最高。再对供试品、对照品溶液进行全波长扫描，发现白术内酯Ⅱ在275 nm，白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、苍术酮在220 nm 处有最大吸收，其余成分在220、250、300 nm 处均有吸收。为了使各成分色谱峰的峰高协调统一，最终确定300 nm 作为主要检测波长，并选择“2.2”项下切换程序。
3.2 含量分析 不同批次玉屏风口服液中各成分含量差异较大，其原因可能来自生产工艺和原药材，其中前者浓缩、醇沉淀、过滤等流程未作参数规定，主观经验依赖性强，个体差异大；
后者产地、基源、生长方式、年限、用药部位、炮制规格等因素均会影响质量一致性［19⁃23］。本实验通过主成分分析得到5 个区分不同批次样品的关键成分（芒柄花素、升麻素、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮），可更好地控制其质量一致性。
本实验建立HPLC 法同时测定玉屏风口服液中12 种成分的含量，并进行质量一致性评价，该方法简便、可靠、准确，检测指标全面，可为该制剂质量控制研究提供新思路，也能为提升其质量评价标准提供参考。
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