Cu2+、Ag+和Hg2+冲击对好氧活性污泥胞外聚合物含量及组成的影响*

雷江，刘彤，梁娜，张耀中**，邱晓鹏，郑兴

(1. 陕西蔚蓝节能环境科技集团有限公司，陕西西安 710018；
2. 西安理工大学市政与环境工程系，陕西西安 710048；
3. 西北旱区生态水利国家重点实验室，陕西西安 710048)

胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)是微生物新陈代谢产生的高分子聚合物，其主要组成成分是蛋白质、腐植酸、多糖、DNA和酯类[1]。根据EPS与细胞之间空间位置的差异，EPS可以分为紧紧附着于细胞表面的紧密型EPS(tightly-bound EPS，TB-EPS)和松散地粘附在细胞菌胶团外层的松散型EPS(loosely-bound EPS，LB-EPS)[2]。EPS的浓度和组成受活性污泥系统运行条件如进水水质、温度、pH值、污泥龄(sludge retention time，SRT)、水 力 停 留 时 间(hydraulic retention time，HRT)等的影响[3]；
同时，EPS包裹在细胞外面形成细胞的保护壳，可抵御外界突发环境条件的冲击如重金属废水泄漏、进水盐度波动、温度突变等[4]。但EPS也是造成生物膜反应器膜污染的主要物质[5]。

采矿、冶金、化工、电池制造等行业产生的废水中往往含有大量的重金属离子如Cu2+、Ag+、Pb2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Cr6+、Cr3+等，由 于 重 金属离子具有毒害性、难降解和易累积的特征[6]，重金属废水的处理仍然是现今备受关注的环境问题之一[7]，生物法是最常用的重金属废水治理技术之一[8]。据相关报道，较高浓度的重金属会影响活性污泥的水处理效果，改变EPS的浓度与组成，增加生物膜污染程度及降低微生物活性等[9]。王宇等[10]的研究结果表明，当Pb2+质量浓度分别为0，5，20 mg/L时，出水COD值分别为24，63，92 mg/L；
同时，随着Pb2+质量浓度的增大，总氮和氨氮的去除效率也呈下降趋势。还有研究表明[11]：Hg2+、Cu2+、Cr3+、Cd2+对活性物污泥呼吸的抑制程度随着离子质量浓度的增大呈逐渐升高趋势，4种重金属对微生物毒性由小到大的顺序依次为Cu2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+。Liu等[12]指出，随着Cu2+、Ag+、Hg2+摩尔浓度的增大，EPS中各个分子量分段的有机物会发生不同程度地解体，随后释放至溶解性微生物产物(SMPs)中；
在Cu2+、Ag+和Hg2+浓度相同的条件下，EPS的解体程度由小至大的顺序依次为Cu2+、Ag+、Hg2+，表明重金属废水对活性污泥系统的水处理效果的影响程度较大。

在膜生物反应器中，EPS是导致膜污染的主要因素，EPS的浓度越高，活性污泥的污泥比阻值越大，膜通量下降程度更为显著，但EPS的不同组分对膜污染的贡献程度不同[13]。金鹏康等[14]的研究结果表明：LB-EPS和TB-EPS的组成特征存在明显差异，LB-EPS的主要组成为多糖，而TBEPS的主要组成成分是蛋白质；
同时与TB-EPS相比，LB-EPS中分子量约为400 Da的有机物含量较高。此外，EPS的组成成分较复杂，包含了多种官能团如羟基、羧基、氨基等，此类官能团可通过离子架桥、疏水性相互作用等方式连接阳离子、细胞及其他污染物，在膜表面形成网状的滤饼层，导致膜污染严重[15]，而EPS中大分子有机物是形成滤饼层的关键因素[16]。因此，考察重金属冲击条件下EPS浓度和组成的变化，可为膜污染控制提供技术支撑。

以好氧活性污泥作为研究对象，采用传统比色法、可在线检测有机碳和有机碳含量变化的凝胶色谱分析(LC-OCD)以及三维荧光光谱，考察了Cu2+、Ag+、Hg2+浓度变化对LB-EPS和TB-EPS含量及其组成变化的影响。通过主成分分析、线性回归等数据分析方法，分析了Cu2+、Ag+、Hg2+冲击条件下LB-EPS和TB-EPS的变化规律以及两者之间的相关性，为活性污泥水处理和膜污染控制的技术发展提供了理论依据。

1.1 冲击负荷试验

采用的接种污泥取自西安市第三污水处理厂浓缩池，原污泥稀释5倍后经序批式反应器(sequencing batch reactor，SBR)驯化后投入使用。SBR主体为有机玻璃，有效容积4 L，恒温水箱控制SBR温度为(25±1)℃。SBR采用曝气泵进行潜水曝气，使得溶解氧质量浓度控制在2~6 mg/L。同时，SBR采用人工配水，以葡萄糖为碳源，氯化铵为氮源，磷酸二氢钾为磷源，水样组分见表1。

表1 反应器水样组成

SBR的运行周期为360 min：进水时长50 min，曝气时长240 min，污泥沉降时长50 min，反应器排水时长10 min，闲置10 min。经测试，活性污泥驯化状况较好，其对于配水中的C、N、P的去除率分别为95%，99%，98%，混合液悬浮固体质量浓度(MLSS)稳定在(4.83±0.38)g/L，混合液挥发性悬浮固体质量浓度(MLVSS)稳定在(3.85±0.51)g/L。

为进行重金属离子的冲击负荷试验，从反应器中取适量活性污泥混合液至塑料杯中混合均匀，用自来水和不加碳氮磷的人工配水分别清洗3遍后，将混合液平均等量分配到烧杯中，一份作为空白，其余均为试验组。之后，在烧杯中模拟SBR运行周期完成不同浓度或者不同种类重金属的冲击负荷试验，考察冲击后EPS分子量分布、荧光有机物等特征的变化规律。基于之前的研究[17]，该试验过程中主要选用了重金属Cu2+、Ag+和Hg2+，试验浓度为0.05，0.11，0.16，0.39 mmol/L。

1.2 分析方法

1.2.1 EPS的提取和组分检测

采用加热法提取胞外聚合物，操作步骤[12]：取50 mL活性污泥混合液，在4 000 r/min条件下离心5 min，弃去上清液，随后向离心管中加入(w)0.05% NaCl溶液清洗活性污泥；
然后向离心管中加入70 ℃的(w)0.05% NaCl溶液，补充体积至50 mL，混合均匀之后在4 000 r/min条件下离心15 min，上清液用0.45 μm的滤膜过滤后得到LBEPS；
最后，用(w)0.05% NaCl溶液补充离心管体积至50 mL，在60 ℃水浴中加热30 min后，在4 000 r/min条件下离心30 min收集上清液，上清液经0.45 μm的滤膜过滤之后得到TB-EPS。

不同试验条件下提取得到的LB-EPS和TBEPS的总含量[以1 g挥发性悬浮物(VSS)计，下同]通过总有机碳分析仪检测后用DOC值表示；
LBEPS和TB-EPS中蛋白质和腐植酸含量采用改进的Lowry法检测；
多糖浓度通过蒽酮-硫酸法测试。

1.2.2 EPS的分子量分布检测

EPS的分子量分布采用可在线检测有机碳含量的凝胶色谱分析仪(LC-OCD)分析。LC-OCD分析方法可以检测到EPS中疏水性和亲水性有机物的总含量，同时，EPS中的亲水性有机物可以经凝胶色谱柱按照分子量差异将其分为分子量大于20 kDa的生物大分子(biopolymer)、分子量在1 kDa左右的腐植酸类有机物(humic substances)、分子量为0.3~0.5 kDa的腐植酸“碎片”(building blocks，该部分有机物为腐植酸的降解产物或者前驱体)、小分子有机物(分子量小于0.35 kDa)[18]。

1.2.3 EPS的三维荧光图谱检测

对EPS进行三维荧光图谱检测，检测过程中激发波和发射波分别为240~450 nm和300~550 nm，对应的测试步长分别为2 nm和5 nm。该研究EPS水样中检测到的荧光有机物有蛋白类有机物T、腐植酸类物质A、腐植酸类物质C和腐植酸类物质M。

2.1 重金属冲击对EPS总含量的影响

在不同浓度Cu2+、Ag+、Hg2+冲击条件下，LB-EPS和TB-EPS总含量的变化见图1。

图1 金属离子浓度对LB-EPS和TB-EPS总含量的影响

由图1可见：正常情况下(空白组)，LB-EPS和TB-EPS的质量分数分别为(20.61±1.95)mg/g和(47.47±1.48)mg/g。在活性污泥系统中，TB-EPS的质量分数明显高于LB-EPS的质量分数。随着Cu2+、Ag+、Hg2+浓度的升高，LB-EPS质量分数呈逐渐上升的趋势，而TB-EPS质量分数则表现出相反的变化规律。

当Cu2+冲 击 浓 度 为0.05，0.11，0.16，0.39 mmol/L时，与空白组相比较，LB-EPS的质量分数分别上升了0.89，3.19，5.73，9.63 mg/g，而对应的TB-EPS的质量分数分别下降了2.53，7.93，12.45，15.18 mg/g，表明Cu2+离子的冲击破坏了TB-EPS层的结构，使得TB-EPS解体并溶解至结构更为松散的LB-EPS中；
Cu2+浓度越高，TBEPS层的结构变化也更显著，对细胞完整性和新陈代谢功能的影响也逐渐增大。当Cu2+浓度为0.39 mmol/L时，SEM的测试结果显示小部分微生物细胞膜的完整性被严重破坏[18]。

与Cu2+冲击对比，Ag+冲击条件下的EPS总含量呈现类似的变化规律，但变化程度更为显著。当Ag+浓度分别为0.05，0.11，0.16，0.39 mmol/L时，跟空白组对比，LB-EPS的质量分数分别上升了5.35，14.25，10.93，11.06 mg/g，而对应的TB-EPS的质量分数分别下降了2.12，14.44，21.05，26.83 mg/g。

Hg2+冲击对EPS质量分数的影响最为显著，当Hg2+浓度分别为0.05，0.11，0.16，0.39 mmol/L时，LB-EPS的质量分数分别上升了5.88，13.31，13.52，15.47 mg/g，而对应的TB-EPS的质量分数分别下降了20.32，20.47，20.73，24.98 mg/g。

综上，Cu2+、Ag+，Hg2+冲击对LB-EPS和TBEPS影响程度为：Hg2+冲击对活性污泥的水处理能力和细胞完整性的影响程度最大，Ag+冲击的影响次之，Cu2+冲击的影响最小。

2.2 重金属冲击对EPS主要组成成分的影响

EPS的主要组成成分为蛋白质、腐植酸和多糖[1]。在正常情况下，LB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖质量分数分别为(5.26±0.15)，(9.20±0.01)，(2.89±0.21)mg/g，TB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖质量分数分别为(15.85±0.17)，(17.01±0.42)，(18.53±1.03)mg/g。显然，与LB-EPS组成相比，TB-EPS中3种组分的质量分数均明显更高。LB-EPS和TBEPS组成特征的差异是影响其表面电荷、亲/疏水性以及絮凝能力的重要因素，进而会影响EPS的团聚状态[19-20]。不同浓度Cu2+、Ag+和Hg2+冲击条件下，LB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖质量分数的变化特征见图2，TB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖质量分数的变化特征见图3。

图2 金属离子浓度对LB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖rrfrfjrfjg质量分数的影响

由图2可见：当Cu2+浓度小于0.16 mmol/L时，随着其浓度的升高，LB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖的质量分数均明显升高；
当Cu2+浓度达到0.39 mmol/L时，LB-EPS腐植酸和多糖质量分数增幅较为显著，分别是空白对照组中腐植酸和多糖质量分数的2.6倍和5.6倍。

随着Ag+浓度的增大，LB-EPS中蛋白质和多糖质量分数均逐渐升高，分别是空白组的1.7~2.7倍和1.3~4.6倍；
而LB-EPS中腐植酸质量分数则呈现先升高后下降的趋势。

随着Hg2+浓度的增大，LB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖的质量分数均逐渐升高，分别是空白对照组的2.3~2.9倍、1.2~1.3倍和3.5~7.6倍；
但当Hg2+浓度达到0.39 mmol/L时，LB-EPS中各组分质量分数均呈现下降的趋势。

由图3可见：当Cu2+浓度小于0.16 mmol/L时，随着其浓度的增大，TB-EPS中蛋白质和腐植酸质量分数呈逐渐下降的趋势，但多糖质量分数变化规律并不显著。当Cu2+浓度达到0.39 mmol/L时，TB-EPS中蛋白质质量分数急剧下降，但TB-EPS中腐植酸和多糖质量分数则有所上升，分别是空白对照组中对应物质质量分数的1.5和1.3倍。随着Ag+浓度的升高，TB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖质量分数均呈现出逐渐下降的趋势。随着Hg2+浓度的升高，TB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖均呈现下降趋势。

图3 金属离子浓度对TB-EPS中蛋白质、腐植酸和多糖质量分数的影响

总体分析，当重金属离子浓度小于0.16 mmol/L时，Cu2+、Ag+、Hg2+的冲击使得LB-EPS中各个组分的质量分数有所增加，TB-EPS中各个组分质量分数有所下降。当重金属离子浓度达到0.39 mmol/L后，EPS中各个组分的质量分数呈现出与低浓度条件下不同的变化特点，这是由于此时重金属离子浓度对微生物代谢功能造成严重破坏[18]。此外，在Cu2+、Ag+、Hg2+冲击条件下，蛋白质、腐植酸和多糖的变化特点存在差异，主要是跟不同重金属离子对微生物的毒性作用机制相关。有研究显示[21]，Hg2+的冲击会影响到微生物新陈代谢过程中的磷酸化过程，进而会破坏细胞膜结构的完整性；
Ag+的冲击则会影响到抗氧化酶的合成过程，且有可能导致微生物代谢过程中发生DNA错误折叠；
而Cu2+的冲击则会影响线粒体中物质合成与分解相关的电子传递过程。

2.3 重金属冲击对EPS分子量分布的影响

EPS的分子量分布特征也是相关学者关注的热点[16,22]，在不同浓度Cu2+、Ag+、Hg2+冲击条件下，LB-EPS中分子量分布的变化特征见图4，TB-EPS中分子量分布的变化特征见图5。根据测试图谱，LC-OCD的检测结果主要为疏水性有机物和3种不同特征的亲水性有机物，3种不同特征的亲水性有机物的出峰时间分别为：生物大分子(biopolymer)(40~70 min)、腐植酸类有机物(humic substances和building blocks的总和，Hu+BB)(70~90 min)、小分子有机物(LMW substances)( 100~120 min)。在正常情况下，LB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数分别是1.51，1.58，1.44 mg/g，TB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数分别是3.27，6.63，4.91 mg/g(分别是LB-EPS中质量分数的2.2倍、4.2倍和3.4倍)。

图5 金属离子浓度对TB-EPS分子量分布的影响

由图4可见：随着Cu2+浓度的升高，LB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数均有所上升，分别是空白对照组的1.2~1.4倍、1.7~2.6倍和1.1~2.5倍。

随着Ag+浓度的升高，LB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数均有所上升；

LB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数是空白对照组的1.0~1.4倍、1.5~3.0倍和1.3~2.0倍。

随着Hg2+浓度的升高，LB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数分别是空白组的1.2~2.0倍、1.9~4.4倍和1.2~3.2倍。

由图5可见：随着Cu2+浓度的升高，TB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数呈现逐渐下降的趋势。随着Ag+浓度的升高，TB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数均呈现显著的下降趋势。随着Hg2+浓度的升高，TB-EPS中生物大分子、腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数分别下降至了空白组的40%~50%、60%~70%和10%~70%。

综上，在Cu2+冲击条件下，相较生物大分子和小分子有机物，LB-EPS和TB-EPS中腐植酸类有机物的质量分数变化最显著；
Ag+冲击对LBEPS中腐植酸类有机物的影响最为显著，但对TBEPS中小分子有机物含量的影响最为显著；
在Hg2+冲击条件下，与生物大分子和小分子有机物相比，LB-EPS中腐植酸类有机物的变化最为明显，而TB-EPS中腐植酸类有机物和小分子有机物的质量分数变化较明显。此外，Hg2+冲击对LB-EPS和TB-EPS中不同分子量的有机物组分的影响显著高于Ag+和Cu2+冲击造成的影响。

2.4 重金属冲击对EPS中有机物荧光强度的影响

三维荧光光谱是一种快速、选择性高且灵敏的检测技术，广泛应用于EPS中荧光组分的测试[23]。在不同浓度Cu2+、Ag+、Hg2+冲击条件下，LB-EPS中荧光有机物荧光强度的变化见图6，TB-EPS中荧光有机物荧光强度的变化见图7。

由图6可见：与空白对照组对比，当Cu2+浓度小于0.16 mmol/L时，随着Cu2+浓度的升高，蛋白类(T)和腐植酸类(A+C+M)有机物的荧光强度均有所升高，分别是空白对照组的1.2~1.5倍，但这两大类有机物所占百分比未发生显著变化，分别为(66.4±2.8)%和(34.6±2.8)%；
当Cu2+浓度上升至0.39 mmol/L时，LB-EPS中腐植酸类有机物质量分数继续增大，蛋白类荧光有机物的质量分数反而有所下降，同时，其所占百分比下降至60.0%。此外，随着Cu2+浓度的升高，LB-EPS中蛋白类和腐植酸类有机物的荧光位置未发生显著变化。

图6 金属离子浓度对LB-EPS中有机物荧光强度的影响

与Cu2+冲击对比，在Ag+冲击条件下，随着Ag+浓度的增大，LB-EPS中荧光组分呈现出类似的变化规律，但变化程度更为显著，荧光强度是空白对照组的1.1~2.0倍。但腐植酸类有机物的特征峰呈现向长波方向移动(红移)的趋势，如特征峰C，其发射波由435 nm逐渐移至440 nm。据相关研究报道，红移代表含有羧基、羟基、烷氧基、氨基等官能团的有机化合物含量的增大；
而蓝移(发射波长向短波方向移动)则表明有机物的分解过程，如大分子有机物降解成小分子有机物、有机物中羧基、羟基和氨基的分解、有机物中共轭键的减少等[25]。因此，Ag+冲击不仅使LB-EPS中各类有机物质量分数发生变化，同时对LB-EPS的结构特征也有一定的影响。

与Cu2+和Ag+冲击对比，Hg2+冲击对LB-EPS荧光组分的影响更显著。当Hg2+离子浓度小于0.16 mmol/L时，LB-EPS中荧光组分强度是空白组的1.2~2.1倍。当Hg2+离子浓度达到0.39 mmol/L后，蛋白类有机物则呈现出较显著的下降趋势(其荧光强度下降至空白组的57%左右)。有研究表明，微生物在正常代谢过程中能够将小分子有机物逐渐转换成大分子有机物[26]，而蛋白和多糖是大分子有机物的主要组成成分，且在应激条件下有可能会产生更多的有机物以保护微生物[27]。因此，在高浓度重金属冲击条件下，蛋白类有机物含量的下降表明微生物防御功能的进一步下降，EPS荧光组分的检测结果再次验证了0.39 mmol/L Hg2+冲击对微生物结构与代谢功能造成严重破坏。

由图7可见：与空白组对比，随着Cu2+浓度的增大，各个荧光有机物的强度呈逐渐下降的趋势(下降至空白组的10%~60%)；
当Cu2+浓度达到0.39 mmol/L后，TB-EPS中各个组分荧光强度的下降幅度较显著，特别是蛋白类荧光有机物。同时，腐植酸类特征峰有轻微红移的趋势。

图7 金属离子浓度对TB-EPS中有机物荧光强度的影响

随着Ag+和Hg2+浓度的增大，各类荧光有机物荧光强度均逐渐降低。同时，腐植酸类荧光有机物也表现出不同程度的红移。此外，重金属离子冲击对TB-EPS的荧光有机物组成的影响顺序由小到大为Cu2+、Ag+、Hg2+，且Cu2+、Ag+和Hg2+冲击促进了LB-EPS中各类荧光有机物的产生，加速了TB-EPS中各类荧光有机物的溶解与释放。

综上分析，在Cu2+、Ag+、Hg2+冲击条件下，LB-EPS和TB-EPS中3种主要组分、不同分子量有机物和荧光有机物含量具有相似的变化趋势。因此，基于上述几种检测方法所得结果，对重金属冲击条件下LB-EPS和TB-EPS中各类有机物进行了主成分分析(principal component analysis，PCA)，主成分1和主成分2占总有机物组分自变量的64.6%，结果见图8。

图8 金属离子浓度对EPS中各类有机物主成分的影响

由图8可见：在重金属冲击条件下，蛋白质和荧光组分T的变化特征与生物大分子的变化特征均显著相关，即生物大分子的主要组成成分是大分子的蛋白质。同时，腐植酸的变化规律与腐植酸类荧光有机物含量的变化趋势最为接近。此外，小分子有机物的变化趋势与多糖特征的变化规律最为相似，即EPS中多糖分子量主要分布在0.35 kDa以下，但组分腐植酸类有机物未与任何有机物呈现较相似的变化规律，这是由于其具有更广泛的分子量分布特征(0.3~1 kDa)，该部分有机物的理化特性更为复杂[28]。同时，根据分子量分布检测结果，与生物大分子和小分子有机物相比，腐植酸类有机物的含量更易受重金属离子冲击的影响。

此外，随着Cu2+、Ag+和Hg2+浓度的增大(小于0.16 mmol/L)，LB-EPS中各类有机物质量分数呈现不同程度的上升趋势，而TB-EPS中各类有机物质量分数则具有持续下降的特征，LB-EPS和TB-EPS总质量分数线性相关分析结果见图9。

图9 重金属冲击对LB-EPS和TB-EPS总质量分数线性相关的影响

由图9可见：LB-EPS与TB-EPS总质量分数呈负相关的关系(R2=0.65)，也即LB-EPS中部分有机物质量分数的增加主要来源于TB-EPS中对应成分的溶解和释放。

以好氧活性污泥作为研究对象，考察了Cu2+、Ag+、Hg2+重金属离子浓度变化对LB-EPS和TBEPS质量分数及其组成变化的影响，得到以下结论。

1)Hg2+冲击对EPS特征的影响最为显著，Ag+冲击的影响次之，Cu2+冲击的影响最小。

2)在Cu2+、Ag+、Hg2+冲击条件下，LB-EPS和TB-EPS中各类有机物变化特征较相似。其中，蛋白质、生物大分子和荧光组分T的变化规律相似，腐植酸与荧光组分A+C+M受重金属冲击的影响程度最为接近，多糖和LMW的变化趋势相符。但与其他组成相比，LB-EPS和TB-EPS中分子量为0.3~1 kDa的Hu+BB对Cu2+、Ag+和Hg2+的冲击最为敏感。

3)在一定浓度范围的Cu2+、Ag+、Hg2+的冲击条件下，LB-EPS中各类有机物质量分数均呈逐渐上升的趋势，而TB-EPS中各类有机物质量分数则持续下降。两者的负相关性分析结果表明：LBEPS中部分有机物质量分数的增大主要来源于TBEPS中对应成分的溶解与释放。当重金属冲击浓度过高时，微生物细胞结构的完整性与新陈代谢功能会严重受损。

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