lncRNA,MACC1-AS1通过靶向miR-429表达对阿尔茨海默病细胞模型损伤的影响
时间：2023-02-16 14:30:10 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
刘少华 张向阳 朱琳 刘典英( 赣州市第三人民医院心理科,江西 赣州 4000; 中国科学院心理研究所; 赣州市第三人民医院司法鉴定室)
全世界阿尔茨海默病(AD)发病例数大约为3.6 亿,研发AD 治疗的新靶点及新思路成为亟待解决的问题,证据显示长链非编码RNA(lncRNA)在调控基因表达中发挥重要作用,可参与多种生物学过程,异常表达的lncRNA 可参与肿瘤等多种疾病发生及发展过程,在大脑发育或生理病理过程中lncRNA 表达异常,其与AD、帕金森病等多种神经退行性疾病密切相关〔1～4〕。lncRNA MACC1-AS1(简称MACC1-AS1)在缺氧诱导的微血管内皮细胞损伤中表达下调,上调其表达可抑制细胞凋亡和氧化损伤,促进细胞增殖〔5〕。靶基因预测显示miR-429 与MACC1-AS1 存在结合位点,miR-429 在氧-葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经元损伤中高表达,下调其表达可抑制OGD/R 诱导的神经元损伤〔6〕。MACC1-AS1 和miR-429 在AD 细胞模型损伤中的表达及其对AD 细胞模型损伤的影响尚未可知。因此,本研究采用β-淀粉样蛋白25～35(Aβ25～35)诱导人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH 建立AD 细胞模型,探讨MACC1-AS1/miR-429 在AD 细胞模型中的表达及其对细胞氧化应激及凋亡的影响。
1.1 材料与试剂 美国Sigma-Aldrich 公司提供Aβ25～35;人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH,武汉普诺赛;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽过氧化酶(GSH-Px)检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;凋亡检测试剂盒,美国Abcam 公司;Trizol试剂,美国Gibco 公司;反转录试剂与SYBR 试剂,大连宝生物工程有限公司;Lipofectamine2000,北京索莱宝科技有限公司;pcDNA,美国Invitrogen 公司;上海吉玛制药技术有限公司提供miR-NC、miR-429 mimics、si-NC、si-MACC1-AS1、anti-miR-NC、antimiR-429;美国Santa Cruz 公司提供兔抗人B 细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)抗体;武汉博士德生物提供二抗。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 SK-N-SH 细胞(1×105个/ml)接种于96 孔板(100 μl/孔),分别加入含有浓度为5 μmol/L Aβ25～35的培养液内培养24 h〔7〕为AD 组。同时将正常培养的SK-N-SH 细胞为Con 组。Opti-MEM 减血清培养基与pcDNA、pcDNA-MACC1-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-429、pcDNA-MACC1-AS1 与miR-NC、pcDNA-MACC1-AS1 与miR-429 mimics 混合后室温孵育5 min(A 液),Lipofectamine2000 转染试剂与改良基本成分营养基(Opti-MEM)减血清培养基充分混合(B 液),A 液与B 液充分混匀后室温孵育20 min,并将其加入SK-N-SH 细胞,转染6 h 弃上清液后更换为正常培养液继续培养48 h,收集转染后的SK-N-SH 细胞加入含有浓度为5 μmol/L Aβ25～35的培养液内培养24 h,分别为AD+pcDNA组、AD+pcDNA-MACC1-AS1 组、AD+anti-miR-NC组、AD+anti-miR-429 组、AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-NC 组、AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-429 组。
1.2.2 qRT-聚合酶链反应(PCR) 检测细胞中MACC1-AS1、miR-429 的表达水平 采用Trizol 法提取各组SK-N-SH 细胞总RNA,反转录后得到cDNA。采用SYBR 试剂检测各组细胞中MACC1-AS1、miR-429 的相对表达量,采用2-ΔΔCt法计算MACC1-AS1、miR-429 的表达水平。
1.2.3 检测MDA、SOD、GSH-Px 水平 采用反复冻融法裂解细胞,用硫代巴比妥酸法检测MDA 水平,用黄嘌呤氧化酶法检测SOD 水平,用5,5"-二硫代双(2-硝基苯甲酸)比色法测定GSH-Px 水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组SK-N-SH 细胞加入2.5 ml/L 含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化细胞,弃胰蛋白酶消化液,加入培养液充分混匀后置于离心管内,经3 000 r/min 转速离心5 min 后弃上清,加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞(2.5×104个/ml),相同条件下离心后弃上清,加入1 ml 预冷PBS 后再次离心、弃上清,加入200 μl 结合缓冲液悬浮细胞,按照凋亡检测试剂盒说明书操作检测各组细胞凋亡率。
1.2.5 双荧光素酶报告基因检测靶向关系 Lnc-Base Predicted v.2 预测显示MACC1-AS1 与miR-429 存在结合位点,miR-NC、miR-429 mimics 分别与WT-MACC1-AS1、MUT-MACC1-AS1 共转染入SK-NSH 细胞后继续培养24 h,收集细胞并检测相对荧光素酶活性。
1.2.6 Western 印迹检测Bcl-2、Bax 蛋白表达 取各组SK-N-SH 细胞后弃培养液,提取总蛋白并进行蛋白定量,取适量蛋白样品加入上样缓冲液后沸水浴10 min 蛋白变性,取蛋白样品(20 μg/孔)经过电泳转移至PVDF 膜,使用TBST 洗涤后加入50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h,加入1 ∶1 000 稀释的一抗后4℃条件下孵育24 h,加入二抗(1 ∶10 000)后室温孵育1 h,滴加电化学发光(ECL)液显影,应用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.3 统计学处理 采用SPSS21.0 软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。
2.1 lncRNA MACC1-AS1 和miR-429 在AD 细胞模型损伤中的表达 与Con 组比较,AD 组MACC1-AS1 表达水平降低,miR-429 表达水平升高,差异均有统计学意义(P＜0.05),见表1。
表1 lncRNA MACC1-AS1 和miR-429 AD细胞模型损伤中的表达(±s,n=9)
表1 lncRNA MACC1-AS1 和miR-429 AD细胞模型损伤中的表达(±s,n=9)
组别MACC1-AS1miR-429 Con 组1.00±0.071.00±0.05 AD 组0.45±0.033.23±0.27 t 值P 值21.666 0.000 24.364 0.000
2.2 lncRNA MACC1-AS1 过表达对AD 细胞模型氧化应激的影响 与Con 组比较,AD 组MDA 水平升高,SOD、GSH-Px 水平降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);与AD+pcDNA 组比较,AD+pcDNAMACC1-AS1 组MDA 水平降低,SOD、GSH-Px 水平升高,差异均有统计学意义(P＜0.05),见表2。
表2 lncRNA MACC1-AS1 过表达对AD 细胞模型氧化应激及凋亡的影响(±s,n=9)
表2 lncRNA MACC1-AS1 过表达对AD 细胞模型氧化应激及凋亡的影响(±s,n=9)
与Con 组比较:1)P＜0.05;与AD+pcDNA 组比较:2)P＜0.05
组别MACC1-AS1 MDA(μmol/L) SOD(U/mg) GSH-Px(U/mg) 凋亡率(%)Bcl-2 蛋白Bax 蛋白Con 组1.00±0.043.82±0.2964.15±4.3649.97±3.425.97±0.380.74±0.040.14±0.02 AD 组0.48±0.041)31.93±2.891) 16.39±1.331) 13.73±1.091) 26.27±2.131)0.31±0.031)0.58±0.031)AD+pcDNA 组0.45±0.0334.33±3.0515.48±1.2812.60±1.1927.59±2.410.28±0.030.59±0.04 AD+pcDNA-MACC1-AS1 组 0.85±0.062)5.53±0.492)52.44±5.042) 37.94±3.322)9.76±0.842)0.65±0.042)0.20±0.022)F 值P 值348.000 0.000 543.326 0.000 467.605 0.000 483.840 0.000 398.243 0.000 394.800 0.000 633.000 0.000
2.3 lncRNA MACC1-AS1 过表达对AD 细胞模型凋亡的影响 与Con 组比较,AD 组细胞凋亡率及Bax 蛋白表达量升高,Bcl-2 蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);与AD+pcDNA 组比较,AD+pcDNA-MACC1-AS1 组细胞凋亡率及Bax 蛋白表达量降低,Bcl-2 蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P＜0.05),见表2、图1、图2。
图1 各组凋亡相关蛋白表达
图2 各组细胞凋亡流式图
2.4 lncRNA MACC1-AS1 靶向调控miR-429 的表达 MACC1-AS1 与miR-429 存在结合位点,见图3。miR-429 过表达可降低野生型载体WT-MACC1-AS1的荧光素酶活性,差异具有统计学意义(P＜0.05),见表3。转染pcDNA-MACC1-AS1 可降低miR-429表达量(1.00±0.06 vs 0.45±0.03),转染si-MACC1-AS1 可增高miR-429 的表达水平(0.99±0.05 vs 3.04±0.23),差异具有统计学意义(P＜0.05)。
表3 双荧光素酶报告实验(±s,n=9)
表3 双荧光素酶报告实验(±s,n=9)
组别WT-MACC1-AS1MUT-MACC1-AS1 miR-NC 组1.04±0.081.01±0.09 miR-429 组0.52±0.041.02±0.07 t/P 值17.441/0.0000.263/0.796
图3 MACC1-AS1 的序列中含有与miR-429 互补的核苷酸序列
2.5 干扰miR-429 表达对AD 细胞模型损伤的影响 与AD+anti-miR-NC 组比较,AD+anti-miR-429组MDA 水平降低,SOD、GSH-Px 水平升高,细胞凋亡率及Bax 蛋白表达量降低,Bcl-2 蛋白表达升高,差异均有统计学意义(均P＜0.05),见图4、表4。
表4 干扰miR-429 表达对AD 细胞模型损伤的影响(±s,n=9)
表4 干扰miR-429 表达对AD 细胞模型损伤的影响(±s,n=9)
组别miR-429MDA(μmol/L) SOD(U/mg) GSH-Px(U/mg) 凋亡率(%)Bcl-2 蛋白Bax 蛋白AD+anti-miR-NC 组1.00±0.0435.95±2.7214.82±1.2411.86±1.1728.62±2.030.27±0.030.60±0.04 AD+anti-miR-429 组0.32±0.028.66±0.5443.74±4.1129.24±2.4510.82±1.020.61±0.040.26±0.02 t 值P 值45.616 0.000 29.523 0.000 20.210 0.000 18.204 0.000 23.505 0.000 20.400 0.000 22.808 0.000
图4 干扰miR-429 表达对AD 细胞模型凋亡的影响
2.6 上调miR-429 表达逆转了lncRNA MACC1-AS1 过表达对AD 细胞模型损伤的作用 与AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-NC 组比较,AD+pcDNAMACC1-AS1+miR-429 组细胞凋亡率、MDA 水平、Bax 蛋白表达显著升高,SOD、GSH-Px 水平、Bcl-2 蛋白表达显著降低(P＜0.05),见图5、表5。
图5 上调miR-429 表达逆转了lncRNA MACC1-AS1 过表达对AD 细胞模型凋亡的作用
表5 上调miR-429 表达逆转了lncRNA MACC1-AS1 过表达对AD 细胞模型损伤的作用(±s,n=9)
表5 上调miR-429 表达逆转了lncRNA MACC1-AS1 过表达对AD 细胞模型损伤的作用(±s,n=9)
组别miR-429MDA(μmol/L) SOD(U/mg) GSH-Px(U/mg) 凋亡率(%)Bcl-2 蛋白Bax 蛋白AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-NC 组 1.00±0.055.42±0.4453.01±4.11 39.27±3.019.81±0.770.67±0.050.19±0.02 AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-429 组 2.96±0.2223.91±2.08 27.32±2.14 22.51±2.15 20.53±2.030.33±0.020.48±0.03 t 值26.06326.09116.63213.59314.81318.94124.129 P 值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000
AD 的发病机制较为复杂,主要特征为渐行性神经元缺失、功能性记忆缺失,Aβ 沉积是促使AD发生的重要原因,Aβ 沉积可促进神经细胞内微管Tau 蛋白磷酸化从而促进神经元细胞凋亡,lncRNA在AD 发生过程中可发挥重要调控作用,其作用机制与竞争性结合miRNA 密切相关,lncRNA NEAT1通过靶向miR-107 而加重AD 神经元损伤〔8〕。沉默lncRNA XIST 可通过miR-124 而抑制AD 的发展进程〔9〕。抑制lncRNA ATB 可通过调节miR-200/ZNF217 轴而抑制Aβ25～35诱导的神经细胞神经毒性〔10〕。MACC1-AS1 在胰腺癌、肝癌等肿瘤中呈高表达,并可促进细胞增殖及转移〔11,12〕。但MACC1-AS1 在AD 细胞模型损伤中的表达及其作用机制尚未可知。本研究结果提示,MACC1-AS1 在AD 细胞模型损伤中可能发挥重要调控作用。机体受到感染或疾病等的影响时会促使氧化/抗氧化系统失衡最终造成组织或细胞损伤,SOD、GSH-Px 属于抗氧化酶,其可清除氧自由基或氧化应激产物从而保护神经细胞,MDA 属于促氧化酶,其可促进氧化应激发生〔13〕。本研究结果提示,MACC1-AS1 过表达可抑制Aβ25～35诱导的SK-N-SH 细胞氧化应激从而减轻AD 神经细胞损伤。氧化应激是AD 细发病与神经细胞凋亡的主要原因,Aβ25～35可通过促进Bax 的表达及抑制Bcl-2 的表达从而促进细胞凋亡进而造成神经细胞损伤〔14〕。本研究结果显示,Aβ25～35诱导的SK-N-SH 细胞凋亡率升高。
为进一步探究MACC1-AS1 在AD 发生过程中的作用机制,本研究证实MACC1-AS1 可充当miR-429 竞争性内源RNA 分子。miR-429 下调表达通过增加Notch1 表达而抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡〔15〕。miR-429 调节肺泡巨噬细胞炎性细胞因子的产生,并参与LPS 诱导的急性肺损伤〔16〕。抑制miR-429 可以改善颅脑损伤小鼠的神经功能,并减轻小神经胶质神经炎症〔17〕。本研究结果提示,抑制miR-429 表达可抑制Aβ25～35诱导的SK-N-SH 细胞氧化应激及凋亡从而减轻AD 神经细胞损伤。同时,本研究采用MACC1-AS1 过表达与miR-429 过表达联合作用于Aβ25～35诱导的SK-N-SH 细胞,结果提示miR-429 过表达可逆转MACC1-AS1 过表达对Aβ25～35诱导的SK-N-SH 细胞氧化应激及凋亡的作用。
综上,MACC1-AS1 过表达可通过下调miR-429而抑制Aβ25～35诱导的SK-N-SH 细胞氧化应激及凋亡从而减轻AD 神经细胞损伤,MACC1-AS1/miR-429 可能作为AD 治疗的潜在靶标,还可为进一步阐释AD 的发病机制奠定实验基础。但AD 发生过程中MACC1-AS1/miR-429 轴如何调控下游靶基因表达及相关信号通路表达仍需进一步探究。
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