十种中草药对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌体外抑菌效果研究
时间：2023-02-12 14:25:07 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
王雅如，赵丹，杨翼航，杨凯迪，韩子荟，张旭
（晋中信息学院，山西晋中 030800）
大肠杆菌是一种很常见的革兰氏阴性菌，大量存在于环境中、寄生于动物的肠道中，分为共生菌株和致病性菌株[1]。宿主健康状态下一般不会致病，如果菌群失衡受到致病性菌株感染或者寄主的免疫力下降则有可能会引发腹泻、胆囊炎、腹膜炎、肋膜炎等疾病甚至死亡[2]。金黄色葡萄球菌是一种很常见的革兰氏阳性菌，也是极为常见的致病菌之一，可引发局部化脓、肺炎、脓毒症等疾病[3]。由于抗生素的滥用使很多致病菌的耐药性越来越强，在严重威胁人和动物的健康，加大防治难度。本实验选取的射干、金银花、黄连等中草药是自然界常见的植物，含有可以有效抑菌的成分，且具有靶位多、广谱性、不易产生耐药性等优点。因此，本实验通过水煎法和醇提法两种方式获得的中草药提取物研究其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果。
1.1 实验材料
大肠杆菌（菌株编号为：ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（菌株编号为：ATCC29213），美国典型培养物保藏中心（ATCC）；
五倍子、乌梅、车前草、金银花、射干、苍耳子、黄连、白芷、薄荷与白术，山西老曙光药店。
1.2 试剂与仪器
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、LB肉汤培养基，杭州百思生物技术有限公司；
95%乙醇、无水乙醇和甲醇，分析纯，天津市北辰方正试剂厂。
BSA224S型电子分析天平，德国Sartorius公司；
JXFB-0电热鼓风干燥箱，苏州巨兴烘箱设备有限公司；
DHP-9012电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；
ZQZY-AF8振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；
YM30立式压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司；
KDC-140HR型离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。
1.3 水煎法提取中草药的有效成分
将药材放进粉碎机打成粉末后称取20 g，加入150 mL去离子水浸泡24～30 h，强火煮沸后改为文火煎煮30 min，用4层纱布过滤，滤液放入4 ℃冰箱冷藏保存；
滤渣加入150 mL去离子水浸泡30 min，强火煮沸后改为文火煎煮30 min，4层纱布过滤，合并滤液。7 000 r/min离心5 min去除药液中残留的药粉，95 ℃蒸发浓缩后120 ℃、15 min高温高压灭菌，并用无菌水定容至20 mL，使药液浓度为1 g/mL，放入4 ℃冰箱中冷藏备用[4]。
1.4 醇提法提取中草药的有效成分
将药材放进粉碎机打成粉末后称取20 g，加入150 mL的95%乙醇，20 ℃、120 r/min振荡，4天后用滤纸过滤，滤液在7 000 r/min下离心5 min去除残留药物粉末，55 ℃蒸发去除乙醇，并用酸性重铬酸钾检验，以确保彻底去除乙醇，最后用无菌甲醇定容至20 mL，使药液浓度为1 g/mL，放入4 ℃冰箱中冷藏备用[5-6]。
1.5 菌液的制备
将活化好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h；
用接种环挑取单个菌落至10 mL的LB肉汤中，37 ℃振荡培养至0.5麦氏浊度（相当于5×107～ 5×108cfu/mL），即为供试菌液[4,7]。
1.6 药敏纸片的制备
将直径为6 mm的圆形空白药敏纸片放进药物提取液中浸泡40 min，在超净工作台中烘干备用。
1.7 抑菌试验
吸取100 μL的1.5项下所制菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，室温干燥5 min。用无菌镊子夹取药敏纸片贴在平皿表面，每个平皿贴2片1.6项下制备的药敏纸片（同种药材的醇提取物和水提取物各1片）、1片含10 μg庆大霉素的药敏纸片作为阳性对照、1片用无菌水处理过的纸片作为阴性对照，做3组平行试验。37 ℃恒温培养箱中培养24 h后用游标卡尺以不同方向测量抑菌圈直径，记录数据并取平均值[8-9]。抑菌圈小于10 mm表示有轻度抑菌作用，记录为“+”；
抑菌圈直径10～15 mm表示有中度抑菌作用，记录为“++”；
15 mm以上表示有高度抑菌作用，记录为“+++”[10]。
1.8 二倍试管稀释法测定MIC
每种药液准备12支无菌1.5 mL无菌离心管，依次编号，分别加入500 μL的LB肉汤培养基。在1号管中加入500 μL的中药提取原液，混合均匀；
从1号管中取500 μL放入2号管中，混合均匀后取500 μL放入3号管中，重复操作至从9号管吸取500 μL到10号管，10号管混匀后弃去500 μL，然后向各管中加入5 μL菌液。11号管中加入500 μL的LB培养基、5 μL菌液和500 μL无菌水，作为阳性对照；
12号离心管中加入500 μL的LB培养基、500 μL药液和5 μL无菌水，作为阴性对照；
重复3组。37 ℃、220 r/min振荡培养12 h，较为清澈透明的管中菌含量较少，进行平板涂布培养，根据平板上菌落生长情况来判断抑菌效果，在抑菌效果显著的平板中其最低药物浓度为最小抑菌浓度（MIC）[4]。
1.9 24孔板法测定MBC
在MIC试验基础上，取较高于MIC的药液于24孔板中，每孔中放置不同浓度的药液并加入20 μL菌液，做3组平行试验，同时设置阴性对照组和阳性对照组，37 ℃恒温培养12 h，台盼蓝染色镜检，无活菌的孔中所对应的药液浓度中的最低药物浓度为最小杀菌浓度（MBC）[11]。
2.1 中药提取物对大肠杆菌的抑制效果
表1展示了各种中草药的醇提取物和水提取物对大肠杆菌的抑制效果，除了薄荷的醇提取物外其余中草药提取物均对大肠杆菌有抑制作用，其中车前草、金银花、射干和紫花地丁的水提取物效果明显优于其醇提取物；
五倍子、乌梅、黄连、白芷、薄荷和白术的醇提取效果优于其水提取物；
五倍子、金银花、紫花地丁、黄连与白芷的两种提取物抑菌效果差异较大；
对大肠杆菌抑制效果较好的3种提取物为五倍子的醇提取物、乌梅的水提取物和醇提取物。
表1 药材醇提取物和水提取物对大肠杆菌的抑菌效果
2.2 中药提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果
表2展示了各种中草药的醇提取物和水提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果，所有中草药提取物对金黄色葡萄球菌均有抑制作用。其中，五倍子、车前草、金银花、黄连、薄荷和白术的水提取物效果明显优于醇提取物；
乌梅、射干、紫花地丁和白芷的醇提取效果明显优于其水提取物；
乌梅和黄连的两种提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用均明显优于其他中草药提取物。
表2 药材醇提取物和水提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果
2.3 讨论
同种中草药采取不同提取方式的提取液对同一菌种的抑菌效果不同，可能是不同提取方式和溶剂所提取出的抑菌有效成分不同。具体包括3个方面：（1）有效抑菌物质在不同溶剂中溶解度不同；
（2）两种提取方式的提取温度不同，水煎法温较高，可能会使部分有效抑菌物质变性；
（3）提取的时间不同，可能导致所提取到的物质有差异。
同种中草药的同种提取液对不同菌种的抑菌效果不同，可能与提取液中成分对不同菌种的作用机理不同有关。目前对于中草药抑菌作用的机理研究较少，已知的主要抑菌途径有4方面：（1）干扰菌体的正常新陈代谢，破坏其酶活系统；
（2）使蛋白质发生变性，影响菌体生长及繁殖；
（3）改变细胞膜的渗透性，使细胞内维持生命的代谢物质外流或有害物质内流从而导致细胞失活；
（4）抑制或破坏菌体生物被膜的形成[12]。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁结构不同，可通过细胞壁和细胞膜进入胞内作用的物质不同，从而表现出抑菌效果的差异。
综上，乌梅的醇提取物和水提取物对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有高度抑菌作用，可初步判断其广谱性较好；
五倍子、金银花、紫花地丁、白芷和黄连的两种提取物对同一种菌的抑菌效果差异较大；
同一种提取方式得到的五倍子、黄连、白术提取物对不同菌的抑菌效果差异较大。
