CXC趋化因子配体10在癫痫大鼠和细胞炎症反应中的作用及机制研究
时间：2023-02-09 22:50:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
杨 谦，曹冰清，韩 征，薛延莉，康 涛
(陕西省人民医院神经内科，陕西 西安 710068)
癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病，表现为自发性反复发作。持续的癫痫发作能产生脑部持久性改变，并出现相应的神经生物学、认知、心理学以及社会等方面的后果，严重威胁着人类的健康[1-2]。虽然大多数癫痫患者可以通过目前的抗癫痫策略完全控制癫痫发作，但大约30%患者对可用的抗癫痫治疗没有反应，从而发展为难治性癫痫[3]。癫痫的发生给社会带来了巨大的负担，因此迫切需要提高对癫痫发生的分子机制的理解，从而制定有效的癫痫治疗策略。
神经炎症在癫痫发生中至关重要，临床患者分析证明了炎症关键介质的基因表达与癫痫患者的癫痫发作频率间存在显著相关性[4]。不同免疫介导的炎症细胞因子被认为是神经可塑性变化、癫痫发作阈值降低和神经元间异常神经元放电延长的诱导剂[5]。因此，调节炎症因子的表达可能为治疗癫痫开辟新的思路。CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand-10，CXCL10)作为一种趋化因子，参与多种炎症和免疫反应。在以癫痫为常见表现的遗传性疾病结节性硬化症中，施用CXCL10抑制剂可降低癫痫发作频率[6]。对儿童癫痫患者进行RNA-seq分析后发现，CXCL10 RNA表达上调[7]。然而，CXCL10在癫痫中的作用及机制尚不明确。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)作为介导免疫与炎症的重要分子，被认为能够促进癫痫的发生[8]。一项临床调查[9]显示，癫痫患者中TLR4高表达，且其高表达水平与癫痫发作的持续时间延长和发作频率增加有关。因此，TLR4也被认为是癫痫的新型标志物[10]。TLR4/核因子(Nuclear factor，NF)-κB是经典的炎症信号传导途径，参与多种疾病的调节。研究[11]表明，抑制TLR4/NF-κB通路可预防锂-毛果芸香碱诱导的癫痫的发生。本研究旨在利用体内和体外癫痫模型探究CXCL10在癫痫中的作用及机制。
1.1 实验动物 健康成年10周龄雄性Sprague-Dawley大鼠20只，体重210～260 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。每笼2～3只，在室温、自然光环境下给予充足的食物及水。
1.2 主要试剂 人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y购自上海中桥新舟生物科技有限公司；
DMEMF12培养基购自美国HyClone公司；
氯化锂、匹罗卡品、视黄酸、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国Sigma公司；
SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ购自大连宝生物工程有限公司；
TRIzol试剂(批号：15596018)购自美国invitrogen公司；
PVDF膜购自美国Millipore公司；
山羊抗小鼠IgG(批号：ab150113)和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG(批号：ab150077)购自美国Abcam公司；
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、显色试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大鼠分组与癫痫模型制备：将20只大鼠随机分为对照组和模型组，每组10只。模型组大鼠腹腔注射氯化锂127 mg/kg，每30 min重复给予匹罗卡品10 mg/kg，直到大鼠癫痫发作。对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。在癫痫持续状态开始后约60 min，注射安定10 mg/kg以终止癫痫持续发作。随后对大鼠进行安乐死，剖取颞叶组织冻存。
1.3.2 癫痫细胞模型制备：用DMEMF12培养基培养SH-SY5Y细胞(空白组)，视黄酸(RA)处理7 d诱导SH-SY5Y细胞分化，无镁细胞液处理3 h诱导细胞发电，建立癫痫细胞模型(SH-5Y5Y组)。
1.3.3 癫痫模型细胞转染及干预：按照LipofectamineTM3000说明书将过表达空白载体(pcDNA3.1)、CXCL10过表达载体(pcDNA3.1-CXCL10)、干扰阴性对照(si-RNA)和CXCL10干扰RNA (si-CXCL10)分别转染至SH-SY5Y细胞中。在TLR4抑制剂TAK-242和激动剂脂多糖(LPS)处理实验中，按照LipofectamineTM3000说明书将si-RNA和si-CXCL10转染至SH-SY5Y细胞中，24 h以后使用TAK-242(si-CXCL10+TAK-242组)和LPS(si-CXCL10+LPS组)处理12 h，然后各组细胞置于37 ℃、5% CO2条件下继续培养，进行后续试验。
1.3.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CXCL10基因表达：利用TRIzol试剂提取总RNA，将RNA反转录为cDNA。根据Genbank数据库公布的基因序列，利用Primer 5.0软件设计PCR引物。CXCL10正向引物序列为5’-TGAGAGCGAACATCCCAACAA-3’,反向引物序列为5’-TGTCCCCACGATCTTCATCTT-3’，GAPDH为内参基因。qRT-PCR反应体系：cDNA模板2 μl，上正反向引物各0.5 μl，SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μl，无菌去离子水7 μl。反应条件：95 ℃预变性1 min；
95 ℃变性 30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，共 30 个循环。同一实验重复3次，通过2-△△Ct计算相对表达量。
1.3.5 免疫印迹法检测TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白表达：用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取颞叶组织或细胞蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度并进行归一化处理。将样品上样到加样孔内进行SDS-PAGE电泳，被分离的蛋白继续转移到PVDF膜上进行转膜。使用5%脱脂奶粉封闭蛋白，加入一抗孵育过夜。用TBST清洗后，加入二抗孵育1.5 h。使用化学发光底物可视化条带，利用凝胶图像处理系统分析目标条带。
1.3.6 ELISA法检测炎症因子水平：将收集的细胞培养液置于4 ℃离心机中，以1000 r/min离心20 min，取上清液为待测样品备用。按照ELISA 试剂盒说明书进行检测，每个样品设3个复孔，显色后用酶标仪在450 nm波长处测量各孔光密度(OD)值，绘制标准曲线，计算各组样品中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-8水平。
2.1 两组大鼠及两组细胞CXCL10 mRNA表达水平比较 见图1。模型组大鼠CXCL10 mRNA表达水平高于对照组(P<0.05)。SH-5Y5Y组细胞CXCL10 mRNA水平高于空白组(P<0.05)。
注：左图中，与对照组比较，*P<0.05；
右图中，与空白组比较，#P<0.05
2.2 癫痫细胞模型转染后CXCL10 mRNA及炎症因子表达水平比较 见图2。过表达CXCL10升高SH-SY5Y细胞CXCL10 mRNA表达水平，而抑制CXCL10降低了SH-SY5Y细胞CXCL10 mRNA表达水平(均P<0.05)。此外，过表达CXCL10使SH-SY5Y细胞培养液中TNF-α、IL-6和IL-8水平显著上升，si-CXCL10使SH-SY5Y细胞TNF-α、IL-6和IL-8水平显著下降(均P<0.05)。
注：与pcDNA3.1组比较，*P<0.05；
与si-RNA组比较，#P<0.05
2.3 癫痫细胞模型转染后TLR4和NF-κB蛋白表达水平比较 见图3。过表达CXCL10促进了TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白表达，而敲低CXCL10可抑制TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白水平(均P<0.05)。
注：左图为蛋白电泳图。右图中，与pcDNA3.1组比较，*P<0.05；
与si-RNA组比较，#P<0.05
2.4 癫痫模型细胞经TLR4抑制剂和激动剂处理后炎症因子表达水平比较 见图4。与si-CXCL10组比较，经LPS处理的癫痫模型细胞TNF-α、IL-6、IL-8水平上升，而经TAK-242处理的癫痫模型细胞TNF-α、IL-6、IL-8水平显著下降,LPS处理显著逆转了由si-CXCL10导致的炎症因子水平的降低(均P<0.05)。
注：与si-RNA组比较，*P<0.05；
与si-CXCL10组比较，#P<0.05
癫痫是常见的神经系统疾病之一，是一种大脑神经元异常电活动的慢性疾病，特征为无端反复发作的痉挛[12-13]。癫痫的发病机制十分复杂，包括氧胁迫、谷氨酸兴奋毒性、钙超载等[14]。从病理变化开始到癫痫发展以及癫痫持续过程会伴随着基因表达改变、炎症、蛋白质产生和连接变化，这些都可能是药物抑制癫痫发生的目标[15]。越来越多的证据表明，炎症在人类癫痫和癫痫实验模型中起着至关重要的作用[16]。炎症基因网络的某些成分可能成为治疗癫痫一个新的靶点。
CXCL10是一种参与多种炎症和免疫反应的趋化因子。已有研究[17-18]表明，CXCL10广泛参与各种神经系统相关疾病，如脑型疟疾和阿尔茨海默病。降低CXCL10水平并服用阿托伐他汀可缓解脑疟疾[19]。此外，在患创伤性脑损伤和神经退行性疾病的小鼠中CXCL10表达量较高[20]。然而，暂无确切的研究证明CXCL10在癫痫中的作用。最近的一项研究[21]发现，CXCL10在癫痫小鼠模型的侧海马胶质细胞中上调，并可能作为癫痫发生的潜在上游靶点。这提示CXCL10可能参与癫痫的进展。在本研究中，我们证明了CXCL10在体内和体外癫痫模型中表达水平均上调，而敲低CXCL10显著抑制了癫痫细胞中炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8)的表达，降低了神经炎症。
研究[22]表明，TLR4/NF-κB信号在神经系统疾病中具有重要作用并调节癫痫进展。抑制TLR4/NF-κB信号通路有助于促进BV-2小胶质细胞向M2型极化，从而发挥神经保护作用，抑制癫痫的发生[23]。此外，Kleen等[24]发现死亡细胞释放的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)可激活TLR4，导致大鼠模型和人类慢性癫痫发作，而抑制TLR4可以减轻癫痫发作。Iori等[25]也发现在动物模型中激活TLR4通路会增加癫痫发作的易感性。因此，靶向炎症信号通路可能成为一种当前对症疗法中控制癫痫发作的补充方法，特别是在常规治疗难以见效的癫痫形式中[26]。在本研究中，TLR4激活剂LPS显著逆转了由si-CXCL10导致的炎症因子水平降低，而si-CXCL10和TAK-242的双重抑制使炎症因子水平达到最低。因此，我们认为CXCL10能够通过TLR4/NF-κB信号通路影响炎症细胞因子的表达。
综上所述，CXCL10在体外和体内癫痫模型中的表达水平均显著上升，低表达CXCL10通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低了炎症细胞因子水平，从而在癫痫炎症反应中发挥重要作用。本研究证明了CXCL10可能是一种治疗癫痫的新靶点，为研究和治疗癫痫提供了新的理论基础。
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