L-丝氨酸生产菌发酵及合成过程优化研究

郑桂花，邹文安，赵 倩

（1.成都工业学院材环学院，成都 611730；
2.华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室，武汉 430074）

L-丝氨酸是一种不带电、非极性及非必需氨基酸，在食品行业具有十分重要的作用。在100℃下条件下加热食品，加热的过程能够散发出香味，主要是由于氨基酸和糖发生了美拉德反应和斯特勒克降解反应，生成产物2-羟基乙醛，使得混合物具有枫糖浆香味，能够增加食物的风味[1]。

L-丝氨酸位于代谢过程的中间位置，转化较快，不易实现大规模生产。目前，主要采用发酵法、生物酶法、水解及化学合成法生产L-丝氨酸[2-4]。生物酶法具有较强的催化专一性、温和的反应条件等优点[5]。本文采用基因工程菌E.coli-SRZ018产生的丝氨酸羟甲基转移酶催化甘氨酸（glycine，Gly）转化合成L-丝氨酸，催化该步反应的酶是丝氨酸经甲基转移酶（serine hydroxymethyltransferase，SHMT），该酶以5-磷酸毗哆醛（5-pyridoxalphosphate，PLP)作为其辅酶。Gly和丝氨酸之间是互相转换，反应的生理方向是L-丝氨酸断裂成为甘氨酸和N5，N10-亚甲基四氢叶酸，辅酶四氢叶酸（tetrahydrofolic acid，THFA）作为C1基团的载体，所以，在丝氨酸羟甲基转移酶和PLP、THFA两种辅酶因子共同作用下，甘氨酸和甲醛(formaldehyde，HCHO)反应生成L-丝氨酸。在体外，当有一定浓度的THFA时，SHMT也可催化HCHO与Gly可逆地合成L-丝氨酸。

随着酶和细胞固定化技术在氨基酸工业的应用，生物酶法合成L-丝氨酸成为研究热点[6-8]。但生物酶法合成L-丝氨酸存在转化率不高、L-丝氨酸产量不理想等问题，而底物甘氨酸的转化率及L-丝氨酸产量受HCHO浓度影响较大。如果HCHO供应量超过L-丝氨酸消耗量，体系中的HCHO逐渐积累，过量的HCHO和氨基酸的氨基反应生成席夫碱和质子，溶液pH降低，导致反应终止，可能导致底物甘氨酸的转化率不高。因此，本研究旨在从HCHO的供应方式入手，针对酶促转化过程高浓度HCHO导致的反应体系pH下降、抑制底物转化的问题，提出了滴加HCHO策略，同步分析其它因素对转化率和产酸量的影响，为工业化生产L-丝氨酸提供理论依据和技术支撑。

1.1 L-丝氨酸发酵条件优化

1.1.1 试验材料

菌株E.coli-SRZ018为基因工程菌，系本实验室保藏菌株。种子培养基：玉米浆、硫酸镁、谷氨酸钠；
发酵培养基：葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘油、硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、玉米浆、磷酸氢二钾、氯化铁；
玉米浆是由本实验室自有玉米粉经过高温煮沸配置而成。

1.1.2 发酵培养与生物量测定

配置种子培养基，经过灭菌处理、冷却，按照5%的体积比接种，37℃条件下，放置于200 rpm/min的摇床培养，间隔1 h取样一次，测定菌体生物量。分析不同的碳氮源、金属离子和氨基酸等不同成分的培养基，在37℃，pH 6.8，装液量为30 mL/250 mL的条件下，对微生物SRZ018生长和丝氨酸羟甲基转移酶表达的影响。其中，生物量的测定采用蒸馏水稀释发酵液至适当倍数，然后利用紫外分光光度计于600 nm处测定OD600作为菌体量[9]。

1.2 生物酶法合成L-丝氨酸过程优化

1.2.1 试验器材

Gly由美国BIOSHARP公司生产；
磷酸吡哆醛、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、十六烷基三甲基溴化铵和HCHO等由国药集团提供；
THFA是由美国Sigma公司销售提供；
高纯度>96%甲酸由天津光复精细化工研究所生产提供；
以上试剂均为分析纯级别。

Thermo SCIENTIFIC离心机，美国赛默飞公司；
ZHWY-2102培养箱，上海智城；
YM-50高压蒸汽灭菌锅，上海三申；
IMS-50制冰机，常熟市雪科；
JY96-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新芝；
DK-S22电热恒温水浴锅、真空干燥箱，上海精宏。

1.2.2 SRZ018酶活检测

SHMT是L-丝氨酸合成中的关键酶，催化甘氨酸和L-丝氨酸的相互转化[10]。细胞湿重即取一定量的发酵液，6 000 rpm离心10 min收集菌体；
以蒸馏水充分洗涤菌体沉淀后，使用分析天平称取菌体重量。发酵液中SHMT单位重量菌体酶活力大小的酶比活SA(specific activity，SA)计算公式如下所示，比活SA单位U/mg。

比活SA=0.971×A279/菌体重量

1.2.3 菌体处理及酶促转化

催化Gly合成L-丝氨酸的SHMT属于胞内酶，培养发酵一定时间后，离心收集菌体，对菌体进行破壁处理，于5 000 rpm离心10 min，保留上清液，取一定量，依次加入不同浓度的底物甘氨酸、四氢叶酸和磷酸吡哆醛等物质，按照一定速度，滴加甲醛，调整酶促转化混合溶液pH，30℃条件下开始酶促转化，每隔一定时间取样，采用HPLC-ESI/MS确定甘氨酸、L-丝氨酸的含量[5]，并计算底物甘氨酸的转化率。转化率是反应物反应程度的重要表征指标[11-12]，是参与反应的某种物质的量占总加入量的百分率，也表示可逆反应到达平衡时，某反应物的转化率等于某反应物甘氨酸的初始浓度和平衡浓度的差与该反应物的起始浓度比值的百分比。

2.1 L-丝氨酸高产菌株发酵条件优化

2.1.1 不同碳源对SRZ018发酵的影响

碳源是培养基的重要组成，作为生命过程中的能源物质参与菌体生长、产物合成。本研究重点分析葡萄糖、果糖、麦芽糖和甘油4种不同碳源对于工程菌SRZ018的影响如图1所示，发现不同糖类物质对应微生物SRZ018生长量为：果糖（5.17）>麦芽糖（4.01）>甘油（3.50）>葡萄糖（3.20），由葡萄糖为碳源构成的培养基，SRZ018生物量显著低于其它糖类为主的培养基。可能是由于葡萄糖抑制微生物生长可能是由于培养基的高渗透压和发酵过程中分解产生乙酸的抑制作用所致。进一步分析不同浓度的果糖、麦芽糖、葡萄糖和甘油对细胞生长和蛋白质合成的影响（图1），可知果糖对微生物生长的促进效果并不明显，果糖浓度为15.0 g/L的时候，生物量增幅较小，提高了5.6%；
麦芽糖为5.0 g/L的时候，菌体OD600由6.51提高到8.61，提高了32.2%，说明麦芽糖能够促进微生物的生长，可用作种子培养基或者发酵培养基中的速效碳源；
向培养基中加入适量的葡萄糖后，无论是微生物的生长还是酶活力均受到明显抑制；
甘油为8.0 g/L时，OD600为7.042，以甘油为碳源对应菌株SRZ018生物量大于葡萄糖的，酶活差异不明显。随着甘油浓度持续增加至15.0 g/L，表现出抑制作用，超过细胞氧化能力，造成“Crabtree”效应，同时报道发现培养基组分种用甘油代替葡萄糖，有助于减少乙酸物质的合成[13]，由此确定采用8.0 g/L的甘油作为唯一碳源。

图1 不同浓度麦芽糖、葡萄糖、果糖和甘油对SRZ018发酵影响Figure 1 Different concentrations of fructose，maltose，glucose and glycerinum have effect on SRZ018 fermentation

2.1.2 不同氮源对SRZ018发酵的影响

氮源是微生物生长繁殖所需的一类重要营养物质，用于构成微生物细胞并参与生理代谢活动，常用的氮源物质中，通常无机化合物被微生物吸收利用较快，有时也被称为速效氮源，其被利用后会引起体系酸碱度的变化，可起到调节发酵过程的作用。由结果（图2）发现向培养基中加入蛋白胨后，微生物SRZ018的生长和酶活均显著增加。蛋白胨浓度为5 g/L时，菌株OD600达到8.387，增加28.7%，此时酶活达到0.361 U/mg。蛋白胨含有丰富的氨基酸和维生素成分，能够促进微生物的生长代谢。向培养基中添加玉米浆浓度为20.0 g/L时，SRZ018微生物OD600为11.215，增幅超70%。培养基中玉米浆浓度保持增加，生物量持续上升，因此，培养基中添加玉米浆后，无论是微生物的生长还是酶活均显著增加。玉米浆含有丰富的氨基酸和维生素成分，能够促进微生物的生长代谢[14]，而硫酸铵浓度为10.0 g/L时，对应酶活最高为0.4，硫酸铵浓度为15.0 g/L时，菌体OD600超过7.5，促进微生物生长作用显著。硝酸钠对微生物SRZ018生长和SHMT产酶的作用，浓度范围为5～10 g/L时变化显著，在其他浓度范围内变化不显著。结合已有研究，某大肠杆菌在分批次补料发酵过程中，添加多种氮源，促进微生物的生长作用显著[15]。综上，蛋白胨、玉米浆对SRZ018作用较为显著，选择5 g/L蛋白胨和35.0 g/L玉米浆作为氮源。

图2 不同浓度的硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、玉米浆对SRZ018发酵影响Figure 2 Different concentrations of fructose，maltose，glucose and glycerinum have effect on SRZ018 fermentation

2.1.3 无机盐对SRZ018发酵影响

金属离子对细胞的生长和酶的活性具有重要的影响，在微生物发酵生产酶的过程中也经常会在培养基中添加相应的金属离子。一般在配培养基时，钠、钾、钙、镁、硫和磷等元素常以其盐类的形式进行添加，K+是许多酶的激活剂，能够促进糖代谢，适宜的K+浓度，既能够保证菌体增殖，也能保证菌体酶活。铁是过渡元素，存在于细胞色素、铁氧还原蛋白和其他铁硫蛋白、酶的辅助因子中，作为辅酶或活化剂参与许多酶反应，是大多数细菌生长的必要因素。磷是核酸、蛋白质尤其是三隣酸腺苷（ATP）的必需构成元素，参与多种代谢途径的调节。锌、钴、锰、铜、铁和铂等元素大多作为酶的辅基和激活剂，需求量相对较小，往往一些有机氮源中含有，因而无需额外加入。依据前述结果，向含有玉米浆35 g/L、甘油13.60 g/L、MgSO41 g/L以及蛋白胨10 g/L的培养基中，加入不同浓度的磷酸氢二钾等物质，结果（图3）显示K2HPO4浓度为0.8 g/L时，发酵液酶活达到最大，此时发酵液浊度OD600约为10。K2HPO4浓度继续升高为2 g/L时，SRZ018的OD600达最大10.176，提高了13%。而当K+浓度继续上升，将抑制微生物的生长，因此，选择培养基中磷酸氢二钾浓度为0.8 g/L。

图3 不同浓度的磷酸氢二钾、氯化铁对菌株SRZ018发酵的影响Figure 3 Different concentration of K2HPO4and FeCL3effects on SRZ018 fermentation

Fe3+促进微生物生长，当Fe3+浓度为2.5 g/L时，SRZ018的OD600达到最大值14.53，相比提高123%，比活0.38 U/mg，相比提高11.6%。与此相反Fe3+对发酵液中SHMT的合成影响不显著，当浓度超过2.5 g/L时，抑制发酵液中蛋白质的合成。有研究表明大肠杆菌对Fe3+耐受浓度约为0.5 mmol/L[16]，试验所得最适浓度远远超过该数值，推测可能Fe3+与培养基中其他物质发生化学变化，生成沉淀。

2.2 酶法合成L-丝氨酸工艺过程优化

2.2.1 不同浓度甘氨酸对产酸量及转化率的影响

反应温度对底物甘氨酸的转化率及产物产量的影响（图4），发现随着甘氨酸浓度的增大，最终反应液中L-丝氨酸的浓度也不断增大，甘氨酸为15 mmol/L时，单位时间生成L-丝氨酸的量为6.02 g/L，此时转化率为90.6%，甘氨酸的氨基与HCHO发生反应，生成席夫碱，理论上起降低反应体系中HCHO浓度的作用，随着甘氨酸浓度增加，甘氨酸抑制产物的合成，导致产酸量和转化率下降[17-19]。

图4 甘氨酸对转化率及L-丝氨酸的产量影响Figure 4 The effect of glycine on conversion rate and the yield of L-serine

2.2.2 磷酸吡哆醛对产酸量及转化率的影响

由磷酸吡哆醛对转化率及产物产量的影响结果（图5），发现磷酸吡哆醛浓度由0.2 mmol/L增加到0.4 mmol/L时，产酸量、转化率均呈现增加的趋势，磷酸吡哆醛浓度为0.4 mmol/L时，单位时间内产酸量达到峰值7.94 g/L，相应的转化率达到最高88.4%。磷酸吡哆醛浓度由0.4～1.0 mmol/L，单位时间内L-丝氨酸产量依递减，由6.73 g/L减至5.68 g/L。

图5 磷酸吡哆醛对转化率及产物产量的影响Figure 5 The impact of different phosphopyridoxal concentration on conversion rate and the yield of L-serine

2.2.3 不同浓度四氢叶酸对产酸量及转化率的影响

四氢叶酸对转化率的影响如图6所示。可知四氢叶酸浓度为5 mmol/L时，单位时间内合成的L-丝氨酸量为2.57 g/L，四氢叶酸浓度增加至7 mmol/L，合成L-丝氨酸为8.24 g/L。四氢叶酸浓度7 mmol/L时，产酸量、转化率达到峰值，四氢叶酸浓度大于7 mmol/L时，转化率、产酸量均快速减小，如果体系中不添加四氢叶酸，同样Gly、HCHO可以反应生成L-丝氨酸，但前者反应速度是后者的1 000倍。

图6 四氢叶酸对转化率及L-丝氨酸产量的影响Figure 6 The impact of THFA on conversion rate and the yield of L-serine

2.2.4 HCHO添加对产酸量及转化率的影响

酶促转化混合溶液中含甘氨酸15 mmol/L、磷酸吡哆醛0.4 mmol/L和THFA 7 mmol/L，通入一定量氮气，加入甲醛，30°C，150 rpm条件下，连续酶促转化，由试验结果（图7、图8），可知酶促转化1～4 h，HCHO与THFA快速反应合成N5-N10亚甲基四氢叶酸，体系中HCHO被消耗，同时，在SHMT作用下，N5-N10亚甲基四氢叶酸与甘氨酸生成L-丝氨酸，N5-N10亚甲基四氢叶酸上亚甲基转移到甘氨酸结构上生成新的THFA[20]，生成的THFA也可与反应体系中的HCHO反应，因此，根据监测数据发现反应体系始终维持在7.5左右上下略微浮动，此处结果未提供）；
5～8 h时，随着反应进行，由于可逆反应及产物逐渐积累产生抑制作用，L-丝氨酸合成速率逐渐下降，THFA更新速率逐渐下降，体系中THFA浓度减少，体系中HCHO有所剩余，剩余的HCHO与甘氨酸氨基反应，导致pH下降，酶促转化反应逐渐终止，体系中甘氨酸与L-丝氨酸浓度保持不变，此时转化率最高为85.1%[20-21]。据此，推测需要改变HCHO供应方式，尝试HCHO滴加，如果酶促转化反应的体系pH有所下降，即HCHO有所剩余时，减少HCHO供应；
如果反应体系pH超过初始pH时，选择增加HCHO供应量，依据反应信号阻止由HCHO逐渐累积引起的L-丝氨酸合成反应条件的恶化。

图7 未采取甲醛滴加时反应体系中组分及转化率变化Figure 7 The trend of composition and conversion rate when HCHO titration wasn′t used.

图8 甲醛滴加时反应体系中组成成分及底物转化率变化Figure 8 The change of reaction system composition and conversion rate with HCHO titration

为此，开展了验证甲醛滴加方法的敏感性实验，将含有1 mol/L甘氨酸的溶液，向溶液中加入不同量的甲醛，由结果（图9）发现初始pH为6.53时，向溶液中滴加0.1 mL甲醛溶液，终pH为5.90，单位pH变化需要滴加17.2 mmol/L甲醛，溶液初始pH为7.05或7.5时，调整溶液终pH为6.70和7.10时，单位pH变化需要更多的甲醛（27 mmol/L、37 mmol/L）。

图9 酶促转化溶液中含甘氨酸量为1 mol/L时滴加甲醛Figure 9 Formol titration when 1 mol/L glycine contained in mixture

酶促转化混合溶液中含有1 mol/L L-丝氨酸和0.75 mol/L甘氨酸，由结果（图10），发现酶促转化溶液初始pH基本一致的情况下，含L-丝氨酸的溶液下降单位pH需要更多（27.8 mmol/L）的甲醛，因此L-丝氨酸对甲醛滴加方式的敏感性不如甘氨酸。进一步验证了酶促转化溶液中溶液含有1 mol/L甘氨酸与5 mmol/LTHFA时对甲醛滴加是否敏感的试验，发现首次滴加甲醛至浓度为5 mmol/L，溶液初始pH保持不变，溶液初始pH为7.02与7.50时，滴加甲醛止浓度为5 mmol/L，pH同样保持不变，再次滴加甲醛，溶液初始pH略微下降，因此，甲醛滴加是一种检测反应体系中甲醛含量的敏感的有效方式。

图10 溶液中含1 mol/L L-丝氨酸和0.75 mol/L甘氨酸时滴加甲醛Figure 10 Formol titration when 1 mol/L L-serine and 0.75 mol/L glycine were contained

酶促转化混合溶液中含甘氨酸15 mmol/L、磷酸吡哆醛0.4 mmol/L，THFA 7 mmol/L，通入一定量氮气，滴加HCHO，30°C，150 rpm条件下，连续酶促转化，由试验结果（图7、图8）可以看出，酶促转化时间反应0～8 h，实时监测反应体系pH变化，发现反应体系pH在7.46～7.53之间浮动；
pH>7.5时，开始滴加HCHO，滴加HCHO终浓度为10 mmol/L，随着反应进行，酶促转化反应体系中甘氨酸量逐渐降低，HCHO与THFA反应合成N5-N10亚甲基四氢叶酸，体系中HCHO被消耗，在SHMT作用下，N5-N10亚甲基四氢叶酸与甘氨酸生成L-丝氨酸，L-丝氨酸量逐渐增加，底物甘氨酸转化率逐渐增加，8 h时，转化率达到峰值95.6%。

通过对L-丝氨酸产生菌发酵过程培养基组成及发酵条件优化，发现葡萄糖为碳源构成的培养基，SRZ018生物量显著低于其它糖类为主的培养基，葡萄糖抑制SRZ018的生长和SHMT的表达。而甘油对SRZ018的发酵最有利，最佳添加量为8.0 g/L；
蛋白胨、玉米浆对对SRZ018的发酵过程作用显著。磷酸氢二钾促进SRZ018的发酵和产酶，最适添加浓度为0.8 g/L。

进一步优化生物酶法转化合成L-丝氨酸条件，发现30℃时，甘氨酸为15 mmol/L，磷酸吡哆醛为0.4 mmol/L，四氢叶酸为7 mmol/L时，对应转化效率相对较高，针对酶促转化过程高浓度HCHO导致的反应体系pH下降、抑制底物转化的问题，提出了滴加HCHO至终浓度为10 mmol/L的方法，维持反应体系pH7.5，最终底物甘氨酸转化率为95.6%，比未采取滴加甲醛时提高了10.5%。

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