益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠痛觉敏化及骨破坏的影响

宋洪丽，冯永利，王耀焓，冯 利

（1.北京中西医结合医院肿瘤科，北京 100038；
2.中国医学科学院肿瘤医院中医科，北京 100021）

接受抗肿瘤治疗的癌症患者中癌性疼痛的发生率高达60%，在晚期癌症患者的癌痛发生率甚至高达90%［1］，骨癌痛是其最常见的形式，而骨转移被认为是引起骨癌痛最常见的原因［2，3］。骨癌痛贯穿癌症患者诊断及治疗过程，不仅与疾病本身相关，而且癌症相关治疗也可引起骨癌痛。阿片类药物治疗骨癌痛临床效果欠佳，不仅易出现恶心、便秘等副作用，而且阿片类药物可以减缓甚至停止骨重塑，增加骨脆性，严重影响患者生存质量［4，5］。不同于其他类型癌痛，骨癌痛具有急性、炎症性和神经性疼痛的特点，表现为痛觉过敏及痛觉超敏，其分子机制十分复杂，涉及肿瘤细胞、骨细胞、炎症微环境及神经元［6］，良好的骨癌痛动物模型对骨癌痛的机制及药物研究具有重要意义［7，8］。

到20 世纪后期，所有的骨癌痛动物模型都依赖于肿瘤细胞的全身注射，由于肿瘤在肝、肺、大脑等重要器官以及骨中的多个部位发生转移，导致动物健康状况较差，且转移的数量及部位不确定，对疼痛测量造成很大影响［8，9］。局部种植骨癌痛模型目前 应 用 广 泛，2006 年Mao-Ying 等［10］将 大 鼠Walker256 乳腺癌细胞种植到大鼠胫骨骨髓腔内，是目前国内发展较为成熟的骨癌痛模型。本研究参照Mao-Ying 等［10-12］建立大鼠骨癌痛模型，观察以扶正解毒化瘀为组方原则的益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠的痛觉敏化及骨破坏的影响。

1.1 动物及细胞

选择SPF 级体重（200±20）g 成年雌性Wistar大鼠及体重（70～100）g 幼年雌性Wistar 大鼠，购自于SiPeiFu 公司，合格证号SYXK（京）2016-003。大鼠饲养温度为（24±0.5）℃，自由饮食、饮水，大鼠适应环境1 周后开始实验。Walker256 乳腺癌细胞株于北京BNCC 公司购买。

1.2 主要实验仪器及试药

盐酸曲马多注射液（Grunenthal GmbH）；
BME-404 电子式机械测痛仪；
YLS-21A 冷热板仪；
2Biological 公司后肢失能测量仪（YLS-21A 冷热板仪及后肢失能测量仪由中日友好医院中西医肿瘤科贾立群教授实验室提供）。益肾祛痛颗粒（益肾骨康方）为 冯 利 教 授 专 利 处 方（ 专 利 号 ：ZL201310582907.9）组方成分：僵蚕10 g、牡丹皮10 g、山茱萸15 g、山药15 g、茯苓10 g、骨碎补10 g、熟地黄20 g、半枝莲10 g、泽泻10 g、白花蛇舌草10 g，该实验所用益肾祛痛颗粒由北京市卫生局临床药学研究所采用水提工艺，经一步质粒法加工而成，（批号：181029），成人1 日剂量为30 g。

1.3 实验方法

1.3.1 动物造模

1.3.1.1 腹水瘤细胞准备 将Walker256 细胞于液氮中取出，37 ℃水浴快速复苏，取适量细胞置于离心机，离心5 min，转速设置为1 500 r/min，丢弃上清液，加0.5 mL 无菌生理盐水，细胞与盐水比例为1∶1，充分吹打混匀。取1 只幼年雌性Wistar 大鼠，腹部消毒，抽取0.3 mL 细胞悬液，注射入幼鼠腹腔，放回笼中饲养大约3～5 d 后，可见幼鼠腹部膨隆，抽取约少量黄白色浑浊腹水，离心5 min，转速设置为1 500 r/min，丢弃上清液，加入无菌生理盐水清洗。取少量生理盐水与分离好的腹水瘤细胞充分混匀，用细胞计数板于显微镜下计数，并将腹水瘤细胞浓度反复调整为2×107/mL，再将合适浓度细胞混悬液置冰上。

1.3.1.2 造模 取成年雌性Wistar 大鼠，0.3%戊巴比妥钠（1 mL/100 g）采用腹腔注射方式麻醉，固定大鼠四肢，左后肢剃毛、消毒，将胫骨上段内侧切开长1 cm 切口，钝性分离暴露胫骨骨面。在膝关节胫骨内侧面下方约0.5 cm 处用22G 医用注射器针头钻孔，待突破胫骨骨面后，用微量注射器抽取4 μL腹水瘤细胞悬液注入胫骨骨髓腔内，迅速用无菌骨蜡封注射孔。用酒精湿棉球拭去外溢的腹水瘤细胞，缝合切口，皮肤局部消毒，外用适量红霉素软膏防止切面伤口感染。大鼠胫骨髓腔内注射等量无菌生理盐水做为假手术组，余操作同造模组。

1.3.2 分组及给药 待模型成功后随机分为假手术组（A 组）、模型组（B 组）、阳性药组（C 组）、低剂量组（D 组）、中剂量组（E 组）、高剂量组（F 组），每组各10 只，造模后第14 天开始药物干预。中药组：益肾祛痛颗粒灌胃，大鼠灌胃体积为1 mL/100 g。每日1 次，连续14 d；
将颗粒药物用清洁饮用水充分溶解，根据人与大鼠体表面积比例换算成所需药物浓度：D 组：药物浓度为0.175 g/mL；
E 组：药物浓度为0.35 g/mL；
F 剂量组：药物浓度为0.7 g/mL；
C组：盐酸曲马多注射液，用无菌注射用水稀释成浓度10 mg/kg，腹腔注射，每日1 次，连续14 d。A 组、B 组：给予等体积清洁饮用水灌胃，每日1 次，连续14 d。

1.3.3 大鼠骨癌痛模型行为学观察 造模日视为0 d，于造模前、造模后第4、7、14、21、28 天测量机械性痛阈值、热痛阈值、后肢负重差，测量时段为9 时～16 时。

1.3.3.1 机械性痛阈值测量方法 将大鼠放置于有

机玻璃笼内，体积为9 cm×12 cm×18 cm 的、底部为孔径0.6 cm 的金属孔板，待其适应20～30 min 后，用电子测痛仪测量探针避开足垫刺激大鼠左后肢足底，待其抬足测量结束，连续刺激5 次（需在1 min内测量完成），每次间隔10 s 以上，取痛阈值算数平均值。

1.3.3.2 热痛阈值测量方法 电子冷热板仪温度设定为（55±0.2）℃，将大鼠置于热板仪内开始计时，当大鼠出现舔后足时，其测量时间视为大鼠的热痛阈值。实验开始前剔除4 s＜热痛阈＜30 s 的大鼠，每只大鼠连续测量3 次，每次测量至少间隔5 min，取3 次算数平均值。

1.3.3.3 后肢负重差测量方法 将各组大鼠置于2Biological 后肢失能测量仪盒内，前肢放于盒内斜面，后肢分别踩踏于底部2 个独立重力传感器，大鼠躯干尽量保持中轴，待其适应2～3 min 后开始测量，将仪器测量时间设置为5 s，仪器显示大鼠左右后肢负重值，连续测量3 次，取3 次测量算数均值，后肢负重差=（右侧后肢-左侧后肢）负重值，计算差值。

1.3.3.4 影像学评价 将模型组大鼠麻醉，于中国中医研究院骨伤科医院放射科对大鼠左后肢行X光检查，观察模型组大鼠造模后7、14、21、28 d 骨质情况。

1.3.3.5 病理学评价 造模后28 d，各组大鼠随机抽取3 只，麻醉后迅速剪下大鼠左后肢，剥离皮肤、肌肉组织，胫骨于4% 多聚甲醛固定液固定。10%EDTA 脱钙4 周，经石蜡包埋、切片，采用HE染色，镜下观察各组骨组织肿瘤破坏情况。

1.4 统计学处理

应用SPSS 25.0 进行数据分析，计量资料以（±s）进行表示，非正态分布数据应用非参数检验方法，正态分布数据应用t检验方法，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.1 模型评价

本实验模型采用观察骨癌痛大鼠痛觉敏化所致行为异常与影像学改变结合来评估造模成功。造模后大鼠热痛阈值、机械性痛阈值持续降低，造模后14 d 可见阈值趋于相对稳定，表明大鼠痛觉敏化形成，符合骨癌痛的特点。

影像学改变：X 线检查示造模各组大鼠7 d 胫骨未见明显骨质异常，14 d 胫骨骨皮质可见少量缺损灶，透光度增加，说明造模成功。而模型组21、28 d继续观察，发现大鼠骨组织进一步破坏，造模后28 d胫骨骨皮质严重损坏，骨小梁残缺不全，胫骨周围组织严重肿胀，可见溶骨性骨破坏。见图1。

图1 骨癌痛模型大鼠胫骨X 线Fig 1 X-ray of tibia of rats with bone cancer pain in each group

2.2 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠机械性痛阈值的影响

机械性痛觉敏化可以通过测量机械痛阈值来衡量。由表1 可见，模型组大鼠造模14 d，痛阈值降低至9 以下趋于平稳。造模后7～28 d，模型组及益肾祛痛颗粒各组大鼠痛阈值均低于假手术组（P＜0.05）；
造模21、28 d：益肾祛痛颗粒各组及阳性对照组大鼠痛阈值高于模型组（P＜0.05），而中剂量组相较于阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠机械性痛阈值的影响（g，n=10，±s）Tab 1 Effect of Yishen Qutong granula on mechanical pain threshold in rats with bone cancer（g，n=10，±s）

表1 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠机械性痛阈值的影响（g，n=10，±s）Tab 1 Effect of Yishen Qutong granula on mechanical pain threshold in rats with bone cancer（g，n=10，±s）

注：与A 组比较，*P＜0.05；
与B 组比较，#P＜0.05；
与C 组比较：△P＜0.05。

28 d 26.44±3.20 7.86±1.58*21.87±4.45*#12.98±3.02*#△18.29±3.69*#13.98±6.85*#△组别A 组B 组C 组D 组E 组F 组0 d 26.43±3.66 25.49±2.74 24.75±2.56 25.64±4.10 25.99±3.07 25.24±3.41 4 d 22.87±2.65 21.33±3.31 21.03±4.23 20.94±5.43 22.47±3.90 21.63±4.29 7 d 23.77±2.43 18.04±3.26*17.51±2.38*18.55±3.49*18.51±4.13*18.26±3.40*14 d 26.43±2.80 8.91±2.64*10.15±3.79*9.49±2.72*10.19±3.15*10.61±2.15*21 d 26.20±3.34 8.24±3.27*20.83±3.85*#16.13±3.55*#△17.64±3.09*#13.83±4.80*#△

2.3 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠热痛阈值的影响

热痛觉过敏可以通过测量大鼠对热刺激的反应时间来衡量。由表2 可知，造模后4 d 造模各组热痛阈值继续降低而假手术组回升至术前，造模14 d，模型组及益肾祛痛颗粒各组大鼠热痛阈值显著低于假手术组（P＜0.05）；
造模后21、28 d，益肾祛痛颗粒中剂量组、阳性对照组热痛阈值显著高于模型组（P＜0.05），且中剂量组相较于阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠热痛阈值的影响（s，n=10，±s）Tab 2 Effect of Yishen Qutong granula on thermal pain threshold in rats with bone cancer（s，n=10，±s）

表2 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠热痛阈值的影响（s，n=10，±s）Tab 2 Effect of Yishen Qutong granula on thermal pain threshold in rats with bone cancer（s，n=10，±s）

注：与A 组比较，*P＜0.05；
与B 组比较，#P＜0.05；
与C 组比较：△P＜0.05。

组别A 组B 组C 组D 组E 组F 组28 d 7.52 ±1.18 4.10±0.53*6.20±1.41*#4.57±0.98*△5.74±0.89*#4.61±0.68*△0 d 8.23±2.43 7.58±1.21 8.27±1.04 7.91±1.30 7.43±1.25 7.34±1.52 4 d 7.14±2.13 7.00±1.42 6.97±1.76 7.85±2.22 7.50±1.63 6.51±1.17 7 d 7.18±1.52 5.96±0.87 6.58±1.55 6.33±1.17 7.13±1.83 6.37±1.01 14 d 6.94±1.46 4.67±0.64*5.02±0.96*4.81±1.18*5.07±1.09*5.01±0.86*21 d 7.21±1.43 4.54±0.63*5.35±1.04*#5.09±0.75*5.42±0.69*#4.56±0.90*

2.4 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠双后肢负重差的影响

痛觉超敏可以通过测量大鼠双后肢负重差来衡量。由表3 可见，各组大鼠在造模4 d 后肢负重差值略增大，随后假手术组负重差值逐渐减小并与造模前差值相当，模型组与益肾祛痛颗粒各组负重差值继续增大。造模7～28 d，益肾祛痛颗粒各组及模型组大鼠后肢负重差明显高于假手术组（P＜0.05）；
造模21、28 d，益肾祛痛颗粒各组及阳性对照组负重差均较模型组负重差小（P＜0.05）；
造模21 d，益肾祛痛颗粒中、高剂量组后肢负重差值显著小于阳性对照组（P＜0.05），而造模后第28 天，益肾祛痛颗粒各组后肢负重差值均较阳性对照组负重差小（P＜0.05）。

表3 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠双后肢负重差的影响（g，n=10，±s）Tab 3 Effect of Yishen Qutong granula on weight-bearing difference of both hind limbs in rats with bone cancer（g，n=10，±s）

表3 益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠双后肢负重差的影响（g，n=10，±s）Tab 3 Effect of Yishen Qutong granula on weight-bearing difference of both hind limbs in rats with bone cancer（g，n=10，±s）

注：与A 组比较，*P＜0.05；
与B 比较，#P＜0.05；
与C 组比较：△P＜0.05。

28 d-0.39±2.00 36.21±10.79*26.58±8.74*#19.38±3.58*#△8.54±4.96*#△15.68±3.77*#△组别A 组B 组C 组D 组E 组F 组0 d 0.10±1.03 0.35±1.64 0.81±3.18-0.31±1.83-0.36±1.75 1.01±4.36 4 d 5.58±2.77 5.92±2.53 6.42±2.41 6.59±2.83 6.29±2.17 6.74±2.43 7 d 2.28±1.35 9.11±2.40*8.08±1.77*8.30±1.78*8.62±1.79*7.59±2.42*14 d 1.09±1.79 15.48±5.00*14.08±3.78*14.93±3.71*13.39±4.22*14.30±3.44*21 d 0.63±1.61 23.02±4.72*16.66±2.79*#13.11±4.83*#9.03±3.06*#△10.81±3.49*#△

2.5 病理学评价

造模28 d，通过HE 染色来观察益肾祛痛颗粒对骨癌痛大鼠骨破坏的影响。观察图2 大鼠胫骨HE 染色图片可见，假手术组骨组织未见异常，骨皮质、骨小梁完整，排列紧密。而造模各组骨小梁均有不同程度破坏、缺失，大鼠胫骨髓腔内可见致密肿瘤细胞。模型组及阳性对照组胫骨皮质破坏不完整，破坏严重，模型组大鼠髓腔内充斥大量肿瘤细胞，骨小梁仅少量残留，骨皮质外可见肿瘤细胞。益肾祛痛颗粒各组骨破坏较阳性对照组轻，其中益肾祛痛颗粒中剂量组骨破坏最轻。

图2 各组大鼠胫骨HE 染色病理图片（×50）Fig 2 Pathological pictures of tibia of rats in each group with HE staining

骨癌痛同时具有炎性疼痛及神经病理性疼痛的病理机制，临床表现为持续性背景痛、爆发痛及痛觉敏化［13］，这种疼痛往往无法缓解，可能发展为慢性疼痛，临床控制不佳，严重损害患者功能状态，缩短生存期［14］。目前晚期骨癌痛的治疗仍以阿片类药物治疗为主，但骨癌痛患者阿片类药物使用剂量普遍较大，恶心、嗜睡、谵妄、便秘甚至肠梗阻等不良反应严重降低患者生存质量，且阿片类药物并不能阻止肿瘤骨破坏，临床中可持续替代的新药及治疗方法迫切需要。中医药治疗骨癌痛方式灵活多样，有中药内服、针刺、药物贴敷、穴位注射、耳穴等方式，安全有效，无明显副作用，中西医结合可具有减毒增效的作用，患者认可度高，临床中有明显优势［15］。

骨癌痛可归为中医学“石疽”“痹症”“骨疽”等范畴。目前多数医家认为气滞、血瘀、寒凝、痰结、热毒等为主要病因，“不通则痛”和“不荣则痛”为主要发病机制［16，17］。因此，课题组根据病因、病机，以“扶正、解毒、化瘀”为治法组成的“益肾祛痛颗粒”在前期多项临床试验中已证实治疗晚期肿瘤患者中重度癌痛、骨转移疼痛中，益肾祛痛颗粒不仅可以有效缓解癌痛患者的持续疼痛症状及爆发疼痛，改善患者的生活质量，还可以有效减少阿片类药物的用量并明显降低其不良反应［18-20］。本实验所用益肾祛痛颗粒由北京市卫生局临床药学研究所采用水提工艺，经一步质粒法加工而成，颗粒制剂不仅保留药物有效成分，而且方便患者携带、服用。

本研究采用Walk256 乳腺癌细胞经幼年雌鼠腹水传递得到腹水瘤细胞，种植到成年雌鼠胫骨内的局部种植造模方式，此方式成模率高达85%，通过影像及行为学综合评价造模是否成功，避免了造模失败产生的误差。本实验腹水采用黄白色浑浊腹水，肿瘤细胞浓度高，实验后期造模大鼠一般状态较好，较血性腹水提取腹水瘤细胞造模的大鼠死亡率明显降低。通过对机械性痛阈值、热痛阈值、后肢负重差进行测量来评价骨癌痛大鼠痛觉敏化。我们观察到造模后4 d，所有大鼠机械性痛阈值、热痛阈值均有降低，后肢负重差值变大，考虑为手术创伤所致的神经性疼痛。但4 d 之后随骨创面愈合，假手术组在痛阈值、负重差等指标慢慢恢复正常，而造模组大鼠随时间推移，肿瘤细胞逐渐生长，并侵蚀骨组织，肿瘤微环境炎症细胞激活，释放大量炎症因子，造成痛觉敏化［21］，因此可见癌痛大鼠机械性痛阈值、热痛阈值逐渐降低，负重差逐渐增大。本研究选用盐酸曲马多为阳性对照药，曲马多为临床中常用的第二阶梯镇痛药物。有研究表明，盐酸曲马多可显著缓解神经病理性疼痛大鼠痛觉过敏［22］。

通过实验观察到，造模后7 d 开始，骨癌痛大鼠机械性痛阈值显著降低，双后肢负重差显著增大，而热痛阈值在14 d 显著降低，热痛觉过敏发生较机械性痛觉过敏晚，而在多项神经病理性及炎性疼痛的动物实验中，大鼠的机械性痛觉过敏及热痛觉过敏可在造模后1～3 d 内出现，甚至最早可在4 h 内发生［23］，这一现象也表明癌性疼痛与炎性疼痛、神经病理性疼痛有区别。通过药物干预1 周后，益肾祛痛颗粒各组及阳性药组均可以显著改善骨癌痛大鼠机械性痛觉过敏及痛觉超敏。药物干预2 周后，益肾祛痛颗粒中剂量组和阳性药组大鼠机械性痛阈值、热痛阈值较前1 周提高，且中剂量组与阳性药组效果相当，低、高剂量组并改善热痛觉过敏，但益肾祛痛颗粒低、中、高剂量组在改善骨癌痛大鼠痛觉超敏方面效果优于盐酸曲马多。这可能由于肿瘤进展，盐酸曲马多不能控制肿瘤对骨组织破坏有关，并且HE 染色可见盐酸曲马多组骨破坏较益肾祛痛颗粒各组严重。

以上表明，虽然盐酸曲马多对骨癌痛大鼠有较好的止痛作用，但并不能减缓其肿瘤所致的溶骨性骨破坏，而益肾祛痛颗粒中剂量组不仅有效改善骨癌痛大鼠痛觉敏化，还可以延缓肿瘤进展，有效改善骨癌痛大鼠的生存质量。

作者贡献度说明：

宋洪丽：负责课题实验操作文章撰写及数据分析；
冯永利、王耀焓：负责课题实验操作；
冯利：负责课题及文章指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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