边缘革蜱GST序列生物信息学分析及表达鉴定

郝蕴伟，翟雪洁，李才善，呼尔查，刘凯强，巴音查汗·盖力克

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

硬蜱(Hard ticks)是寄生于动物体表依靠吸食宿主血液的外寄生虫(也是媒介生物)。革蜱(Dermacentorspp.)隶属于硬蜱科，我国已记录有13种，新疆地区有8种，边缘革蜱(Dermacentormarginatus)是天山区域的优势种[1]，其主要分布于准噶尔界山和山间谷地。蜱虫作为传播媒介能够对畜禽和公共健康造成很大危害，边缘革蜱作为媒介蜱能够携带多种蜱媒病原体。边缘革蜱能给家畜或人类传播的病原体主要有汉坦病毒[2]、巴贝斯虫[3]、立克次体[4]、无浆体[5]、布鲁氏菌和伯氏疏螺旋体[6]等。

蜱虫大量吸食宿主血液，其消化血液过程中会对其自身造成氧化还原压力。饥饿雌蜱在吸取宿主血液饱血脱落后，体重与原体重相比，有88倍～128倍[7-8]的差异。蜱虫在吸取大量宿主血液后体内会发生一系列的代谢反应，而血液代谢的过程中可能会导致蜱虫的活性氧分子过度生成和/或清除减少，最终导致蜱虫体内活性氧类生成与抗氧化防御功能紊乱。生物机体的抗氧化物酶主要有细胞色素P450酶(cytochromeP450，CYP450)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、铁蛋白(ferritin)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)[9]等。

谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GST)是GSH-Px中的一种，是一类具有促进多种亲电子物质、氧化应激产物等与谷胱甘肽的巯基结合而发挥Ⅱ相解毒及抗氧化功能的多基因同工酶家族。GST广泛分布于各种生物体内，能够催化谷胱甘肽和其他有毒代谢产物之间的结合，增加其亲水性，最终帮助有毒代谢物的排出，实现抗氧化应激[10]，在蜱虫的抗氧化应激上发挥着重要作用。GST基因家族在蜱虫中较为发达，研究发现，肩突硬蜱 (Ixodesscapularis)具有35种GST基因[11]。根据上述信息可以作出假设，GST可能在蜱类解毒代谢中发挥重要作用。

本研究以边缘革蜱(Dermacentormarginatus)为研究对象，基于前期边缘革蜱转录组测序数据[12]，结合森林革蜱(Dermacentorsilvarum)基因组数据[13]比对结果，筛选出与氧化应激相关的GST基因。利用生物信息学和分子生物学方法对边缘革蜱GST基因进行分析，筛出边缘革蜱GST(DmGST)功能基因，旨在了解DmGST基因生物学特性以及为后续研究抗边缘革蜱疫苗奠定基础。

1.1 材料

1.1.1 蜱及实验动物 本试验所使用的边缘革蜱为新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室培养的第2代(F2)纯蜱。新西兰大白兔、无菌Balb/c小白鼠购自新疆医科大学实验动物中心。

1.1.2 质粒与菌株 pGEX-4T-1、pET-28a载体由新疆农业大学动医学院寄生虫实验室提供；
pEASY-T1、pMD18-T Vector 北京全式金生物技术有限公司产品；
大肠埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)感受态细胞为Takara公司产品。

1.1.3 基因 边缘革蜱转录组数据由新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室提供。

1.1.4 主要试剂 胰蛋白胨(HB8270)、酵母浸粉(HB8273)等，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；
血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒(DP304)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(增强型)(DP219)、RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(DP451)、FastKing RT Kit(With gDNase)(KR116)第一链合成试剂盒(去基因组)等，天根生化科技(北京)有限公司产品；
质粒提取试剂盒(E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I)，OMEGA试剂盒总代理经销商上海易汇生物科技有限公司产品。

1.1.5 主要仪器 单人净化工作台(SW-CJ-1D)，苏州净化设备有限公司实验室产品；
北利牌高速台式冷冻离心机(GTR16-2)，北京时代北利离心机有限公司产品；
双稳定时电泳仪电源(DYY-6C)，上海沛升仪器设备有限公司产品；
伯乐凝胶成像分析系统(BIO-RAD Gel Doc XR +)、伯乐 PCR 仪(BIO-RAD T 100)，伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 饲蜱试验 通过将F2代边缘革蜱接种于新西兰大白兔左、右外耳使F2代雌蜱处于半饱血状态时，收集至5 mL EP管中，进行总RNA提取。该试验过程受新疆农业大学动物医学学院动物伦理委员会监督。

1.2.2 总RNA的提取和第一链cDNA的合成 将人工饲养的F2代半饱血边缘革蜱雌蜱液氮研磨，装入无酶EP管，随后加入500 μL Trizol，在涡旋仪上混匀，冰浴5 min；
向上述EP管中加入500 μL氯仿，于涡旋仪中振荡混匀，之后按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作；
将提取的总RNA使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒反转录为cDNA，以上步骤均在超净台中操作，获取的边缘革蜱cDNA样品置于-20℃储存备用。

1.2.3 引物设计与目的基因扩增 基于边缘革蜱转录组数据[12]使用Primer 5.0软件设计6种GST基因的引物。GST基因的命名根据Friedman等对昆虫GST基因的命名倡议进行[14]。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。引物序列及PCR反应条件详见表 1。

表1 DmGST引物信息

1.2.4 系统进化分析 将NCBI上Blast比对结果中便于分亚型的蛋白质序列下载归档至同一个文本文档(.txt)中。将蛋白氨基酸序列文件导入CLUSTALX软件，比对分析蛋白质序列，导出格式为.phy格式的文件。然后将其导入Prot Test软件，分析进化树最优模型，最后使用phyML软件构建系统进化树，并使用iTOL(https://itol.embl.de)网页制作进化树模型。

1.2.5 同源性分析DmGST蛋白氨基酸序列的比对，使用NCBI数据库的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行蛋白序列同源性分析。

1.2.6DmGST序列生物学特性分析 使用在线软件ExPASy中的Prot Param(http://web.Expasy.org/protparam/)分析DmGST氨基酸序列得出蛋白质的分子量、等电点、吸光值等理化性质；
使用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测DmGST蛋白的信号肽；
使用 TMHMM (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html)预测DmGST蛋白质跨膜区。采用 Allertop (http://www.ddgpharmfac.net/AllerTOP) Online Available Server 服务器进行过敏性预测。

1.2.7 抗原表位预测 使用IEDB Analysis Resource(http://tools.iedb.org/bcell/)预测氨基酸序列的B细胞线性抗原表位；
使用SWISS-MODEL(https:∥ swissmodel.expasy.org/)预测蛋白的三级空间模型，并将模型上传到在线软件Service(https://services.healthtech.dtu.dk/)中的dicotope-2.0预测蛋白的空间抗原。

1.2.8 原核表达载体构建及4种不同亚型GST表达 将回收的DmGST基因片段物分别连接到pEASY-T1克隆载体中，导入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，加入液体培养基，摇匀(上述步骤均在超净台内完成)。摇菌管倾斜放置于摇床培养，离心后留少量上清与沉淀混匀涂板，筛选阳性单菌落，收集菌液送上海生工进行测序。使用质粒小提试剂盒对4种不同亚型的菌液提取克隆质粒，对克隆质粒和空载质粒进行双酶切(BamHⅠ和EcoRⅠ)，回收空载和目的片段，使用T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，然后将重组质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，经筛选后送测序。测序结果正确后进行扩大培养，OD280 nm值达0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，16℃、诱导表达16 h。收集菌体，并进行超声破碎，离心后收集沉淀、上清制样进行SDS-PAGE电泳。采用His镍柱纯化试剂盒对上清液进行纯化，将纯化后的蛋白用millipore超滤离心管超滤脱盐浓缩后进行免疫。以免疫不同蛋白的鼠血清(二免后14 d)作为一抗(1∶5 000)，以羊抗兔 HRP-IgG(1∶8 000)为二抗，进行Western blot鉴定。

2.1 6种DmGST的基因的克隆

阳性菌液经特异性引物PCR扩增，产物凝胶电泳图可见，在每种DmGST在相应的位置有特异性条带，该条带大小与目的基因大小一致，结果如图1。

M.DNA标准 DL 2 000；
1,2,3,4,5,6.DmGSTE2，DmGSTE3，DmGSTK1，DmGSTM5，DmGSTM6，DmGSTZ2 基因扩增产物。

为证明成功克隆出了相应带有DmGST基因的质粒，将阳性菌液测序结果与目的基因进行比对。

2.2 系统进化分析结果

DmGST基因通过建立系统进化树将其分到不同的亚型。根据Friedman等[11]对昆虫GST基因的命名倡议将筛选出的6种GST命名为DmGSTE2、DmGSTE3、DmGSTK1、DmGSTM5、DmGSTM6、DmGSTZ2。将6种GST命名后上传NCBI，登录号分别为：DmGSTE2(MW280833)、DmGSTE3(MW280834)、DmGSTK1(MW280835)、DmGSTM5(MW280836)、DmGSTM6(MW280837)、DmGSTZ2(MW280838)。

2.3 6种DmGST 推定蛋白的生物信息学分析

2.3.1 6种DmGST 理化性质预测分析 使用ExPASy蛋白组学分析软件分析了边缘革蜱GST基因编码氨基酸序列的组成和理化性质，根据预测结果可知DmGSTE2、DmGSTE3、DmGSTK1、DmGSTM5、DmGSTM6、DmGSTZ2分子式(formula)分别为C1058H1635N259O305S6、C1139H1796N300O324S11、C1414H2283N457O392S9、C1209H1804N318O328S7、C476H755N127O129S5、C1106H1715N273O318S5；
氨基酸数(number of amino acids)分别为 204、225、281、220、93、215；
理论等电点(theoreticalpI)分别为4.95、7.55、9.67、6.92、6.72、5.34，说明DmGSTE3、DmGSTK1为碱性蛋白，其他为酸性蛋白；
不稳定系数(instability index)分别为 47.24、31.44、61.44、41.84、50.34、43.04，DmGSTE3低于阈值40，说明该蛋白质在溶液中性质稳定，其他蛋白质在溶液中性质不稳定；
使用SignalP-5.0、TMHMM预测DmGST蛋白的信号肽、跨膜区，结果显示仅DmGSTM6有信号肽和跨膜区。采用Allertop服务器预测GSTs基因编码氨基酸的过敏性，结果显示，6种蛋白均为非过敏原，该服务器依赖于自动交叉协方差变换的原理，即对不同长度的肽进行序列查询，结果有较高的可信性。

2.3.2 6种DmGST氨基酸序列比对结果 6种DmGST基因通过Blast进行比对可以得知DmGSTE2与边缘革蜱Epsilon基GST、DmGSTE3与变异革蜱Epsilon推定GST、DmGSTK1与肩突硬蜱Kappa基GST、DmGSTM5与微小扇头蜱Mu基GST、DmGSTM6与边缘革蜱Mu基GST、DmGSTZ2与肩突硬蜱马来先乙酰乙酸异构酶同源性强。其中DmGSTE3同源性最高，为87.56%，DmGSTE2同源性最低，为55.56%。

M.Blue Plus Ⅱ Protein Marker。1,3,5,7.pET28a-DmGSTM5，pET28a-DmGSTZ2，pET28a-DmGSTE3，pET28a-DmGSTK1 载体破碎后沉淀；
2,4,6,8.pET28a-DmGSTM5(28.01 ku)，pET28a-DmGSTZ2(28.56 ku)，pET28a-DmGSTE3(27.46 ku)，pET28a-DmGSTK1(28.67 ku)载体破碎后上清。

2.4 抗原性分析结果

抗原性预测并比对，结果显示DmGSTE2、DmGSTM6、DmGSTZ2空间抗原表位完全重合在B细胞线性抗原表位中，一致性表现集中；
DmGSTK1、DmGSTM5空间抗原表位重合在B细胞线性抗原表位之外，均在氨基酸序列的前端出现了不与B细胞线性抗原表位重叠的抗原位点；
DmGSTE3空间抗原表位重合在B细胞线性抗原表位之外，在氨基酸序列的末端位置出现了不与B细胞线性抗原表位重叠的抗原位点，且通过多次建模分析空间位点时，均出现了A链与B链空间抗原表位不对称情况。B细胞线性抗原性强弱顺序可能为：DmGSTM5>DmGSTK1>DmGSTZ2>DmGSTE2>DmGSTM6>DmGSTE3；
空间抗原性强弱顺序可能为：DmGSTM5>DmGSTK1>DmGSTM6>DmGSTZ2>DmGSTE3>DmGSTE2。

2.5 4种不同亚型DmGST的蛋白表达与免疫印迹鉴定

将测序正确的重组菌经IPTG诱导表达，经SDS-PAGE检测结果显示，pET28a-DmGSTM5、pET28a-DmGSTK1、pET28a-DmGSTZ2、pET28a-DmGSTE3重组蛋白大小与预期重组蛋白大小基本一致，并且蛋白主要表达在上清液中。纯化后的蛋白浓度为1.8±0.3 μg/mL，条带较单一，纯化效果较好(图7A)。Western blot检测结果显示，在预期位置出现特异性条带(图7B)，表明获得了GST蛋白，且该蛋白能够与相应蛋白免疫过的鼠血清发生反应。

边缘革蜱作为新疆革蜱的四大优势种之一[1]，其能通过吸血过程将携带的病原微生物输送至宿主体内，引起宿主多种疾病，对畜牧业的发展带来了重大危害。

消灭蜱虫主要为人工除蜱、使用有机磷农药喷洒灭蜱[15]，中西药结合治疗的同时给宿主动物体表涂抹废旧机油[16]、接种抗蜱疫苗。接种抗蜱疫苗被认为是现今最有前景的灭蜱替代方法之一，在减少大量人力物力的同时，能够避免产生动物性食品安全问题及环境污染。然而，截止到现在，还没有一种抗原能超过针对微小牛蜱 (Boophilusmicroplus) 的Bm86疫苗[17]的效能。

M.Blue Plus Ⅱ Protein标准；
1～4.pET28a-DmGSTM5，pET28a-DmGSTZ2，pET28a-DmGSTE3，pET28a-DmGSTK1 重组蛋白；
5.阴性对照

此外，相关研究报道，蜱类控制时使用的蜱类保护性抗原被证实是有效的[18]。长角血蜱的rGST-Hl抗原对微小扇头蜱和附加扇头蜱具有交叉保护作用[19-20]。有研究表明，将蜱GSTs基因作为蜱类疫苗的潜在候选抗原，是因为GSTs基因的功能为降低蜱虫的生长发育、成蜱繁殖力、产卵量和卵的孵化率，因此，能够达成减少蜱虫数量的目的[12,20-22]。

对核酸序列的扩增、克隆、测序、比对说明了从转录组数据中挑选出的这6种基因，不是残基而是能够对应表达蛋白的序列，且为边缘革蜱GST家族蛋白对应的基因；
根据系统进化分析，得出这6个基因归类于Kappa基、Mu基、Zeta基、Epsilion基，同时对6种基因序列进行了上传，为边缘革蜱GST蛋白家族的研究提供了数据支持。

该蛋白理化特性、空间结构、抗原性及抗原表位、过敏性进行的预测分析发现，DmGSTM5、DmGSTZ2、DmGSTE2、DmGSTM6为不稳定的酸性蛋白；
DmGSTK1为不稳定的碱性蛋白，DmGSTE3为稳定的碱性蛋白。抗原性预测及抗原位点标记表明，GST蛋白抗原位点大多在蛋白模型外表面，这将更有利于其被宿主免疫系统识别和捕捉；
对蛋白序列的过敏性预测结果表明边缘革蜱6种GST不会致敏，作为外源性抗原，理论安全性较高。根据B细胞线性抗原表位与空间抗原表位分析结果来看，DmGSTM5抗原性可能最强，DmGSTK1次之。据研究文献中RT-QPCR数据显示Mu基GST与边缘革蜱的摄食相关[12]，预测显示DmGSTM6有信号肽有跨膜区，而核糖体是通过信号肽的功能而附着并合成分泌蛋白的，信号肽可使正在翻译的核糖体附着到糙面型内质网膜(rER膜)上，试验后期可以将Mu基作为候选抗原进行研究，进行抗蜱疫苗的开发，也可与其他候选抗原联合研发混合疫苗。

本试验进行了6种DmGST基因的克隆，成功对6种DmGST基因分亚型。构建了4种表达载体，并对其进行了表达、纯化及验证。预测了6种推定蛋白的理化性质、空间结构、抗原性和过敏性。该研究为边缘革蜱GST家族氧化应激因子的解毒酶GST特性研究，以及蛋白作为抗蜱疫苗候选抗原研究奠定了基础。相同家族蛋白的不同亚基在边缘革蜱虫体内表达量、引起何种抗体表达、免疫效果异同以及混合免疫效果尚未可知，有待后续的研究去发现。

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