江苏某地鸭群中乙型脑炎病毒及其抗体检测
时间：2023-01-19 19:45:15 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
狄 荻，王 欣，李晨曦，李宗杰，李蓓蓓，刘 珂，邵东华，邱亚峰，魏建超，马志永
（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）
乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是有囊膜的单股正链RNA病毒，是黄病毒属的成员之一，其基因组全长约为11 kb[1]。乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）是由JEV引起的一种蚊媒传染病，主要经三带喙库蚊传播，是一种重要的人兽共患病，被世界卫生组织（World Health Organization, WHO）列为重点控制的传染病之一[2]。JE以中枢神经系统的急性炎症及血脑屏障的破坏为主要特征，可以导致25%的死亡率，并且15%～30%的患者会伴随严重的预后不良[3-5]。在自然界中，猪和水禽是JEV的主要扩增宿主，人类和马是终末宿主，包括鸭子在内的水禽在感染后可以产生高水平的病毒血症，并通过蚊子等节肢动物将JEV传播给人类[6-8]。有研究表明，JEV同时对雏鸭具有潜在的致病性[9]。本研究旨在检测规模化养殖鸭群中JEV的感染情况，为JE的防控提供新的思路。
1.1 病料与血清学样品 所有样品均于2019年10月从中国江苏省中部地区某种鸭场采集得到，其中产蛋种鸭血清样本20份以及抗凝血样本各20份，不明原因死亡的1～3日龄雏鸭病料19份，所有样品保存在-80℃冰箱待检测。该养鸭场并未使用过任何JEV疫苗及相关产品。
1.2 主要试剂及引物 JEV酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。阴性鸭血清和阳性鸭血清由本实验室制备；
TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；
2×LATaqPCR Master Mix、Prime Script RT Master Mix、Premix ExTaq™（Probe qPCR）、ROX Reference Dye购自TaKaRa公司；
DL2000 DNA marker购自宝生生物（大连）工程有限公司。反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）引物根据GenBank中JEV（MH753127）高度保守的E基因片段设计，预扩增片段长约475 bp，由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列JEV-F：5"-TTGGTCGCTCCGGCTTACA-3"；
JEV-R：5"-GGTTTTCCGAGGTAGTGGTTC-3"；
E基因全长扩增引物根据GenBank中JEV（MH753127）高度保守的E基因片段设计，预扩增片段长约1500 bp，由上海英骏生物技术有限公司合成，JEV-E-F：5"-TGYTGGTCGCTCCGGCTTA-3"；
JEV-E-R：5"-GATGTCAATGGCACATCCAGT-3"[10]。荧光定量RT-PCR引物JEV-P-F/R、JEV I/III型探针由上海华津生物技术公司合成。
1.3 血清样品JEV抗体检测 采用ELISA对20份产蛋种鸭血清进行JEV特异性抗体检测，健康SPF鸭血清为阴性对照，JEV感染鸭血清为阳性对照，每个样本设一组平行重复检测。方法如下：使用血清稀释液以体积比1∶40稀释待检血清和对照血清；
根据样品数量取用JEV抗原包被板板条，在所需孔中加入200 μL冲洗液，静置3 min，倒出冲洗液后在吸水纸上轻轻拍干；
在每个孔中对应加入100 μL对照血清和待检血清，在37℃恒温箱中孵育30 min，弃去孔中溶液，加入200 μL冲洗液，静置3 min，倒出冲洗液后在吸水纸上轻轻拍干，重复洗涤5次；
每孔加入稀释后的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的羊抗鸭IgG，37℃孵育30 min，弃去孔中溶液并按上述方法洗涤5次；
每孔加入50 μL显色液A和显色液B，室温避光静置10 min；
待显色完成后加入终止液，在630 nm处测量光密度OD值；
根据S/P公式计算样品阳性率。
1.4 样品中核酸提取 病死雏鸭解剖后取心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏及脑组织，加入磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, PBS）后研磨混匀，取组织匀浆液备用；
抗凝血每份取100 μL备用。所有样品加入适量的TRIzol，按照说明书提取病毒总RNA，使用ddH2O溶解。反转录体系如下：RNA模板1 μL，7 μL ddH20，Prime Script RT Master Mix 2 μL。反转录条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。反转录产物保存于-20℃冰箱待检。
1.5 RT-PCR检测JEV基因 采用RT-PCR对组织样品和全血样品进行JEV的E基因检测，扩增体系为：2×LATaqPCR Master Mix 10 μL，JEV-F/R各0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA 2 μL。程序设定：95℃预变性5 min；
95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环；
72℃延伸10 min；
4℃保存，使用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，挑选出JEV样品进行下一步检测。
1.6 全长E基因的扩增及测序 对阳性样品进行JEVE基因全长进行扩增，扩增体系为：2×LATaqPCR Master Mix 20 μL，JEV-F/R各0.2 μL，ddH2O 17.6 μL，2 μL cDNA。程序设定：95℃预变性5 min；
95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35个循环；
72℃延伸10 min；
4℃保存，使用1%琼脂糖凝胶电泳分析上述RT-PCR扩增产物，回收目的片段并送上海桑尼公司测序。
1.7 荧光定量RT-PCR检测病毒组织分布 对9号阳性雏鸭组织样品进行绝对荧光定量RT-PCR检测，检测加样体系：PremixEx Taq™（Probe qPCR）10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，Primer JEV-P-F 0.4 μL，Primer JEV-P-R 0.2 μL，JEVI/Ⅲ型探针0.3 μL，ddH2O 6.5 μL、cDNA 2 μL。StepOne Software v2.3程序设定：95℃预变性30 s；
95℃变性5 s，60℃退火55 s，共40个循环。根据病毒拷贝数计算JEV在不同组织分布。
1.8E基因序列遗传进化分析 将测序所得结果与GenBank中JEVE基因序列进行多序列比对分析。使用MEGA 6.0软件对E基因进行系统发育分析，采用邻位相接法（Neighbor-Joining）构建进化树，Bootstrap值设置为1000来评估进化树的可靠性。
2.1 JEV抗体检测结果 采用ELISA方法对20份产蛋种鸭血清样本进行JEV抗体检测，测量OD值，根据S/P公式计算样品阳性率：S/P平均值≥0.21判定为阳性，S/P平均值＜0.21判断为阴性，结果见图1。所检测的20份样品中，有15份为阳性，JEV抗体阳性率为75.0%。
2.2 RT-PCR检测结果 我们研究发现，雏鸭实验性感染JEV后脾脏的病毒载量最高（未发表结果），所以本研究首先选择雏鸭脾脏样品进行JEV检测。RTPCR检测结果显示，JEVE基因片段的PCR扩增产物电泳后可见约475 bp的条带，与预期片段大小相符（图1）。在所检测的19份未知原因死亡雏鸭脾脏中，9号雏鸭脾脏为阳性，5号和7号样品为弱阳性，其他样品为阴性（图1）。此外，JEV感染鸭后，可形成病毒血症，因此，本研究对鸭血液样本进行JEV检测，在20份产蛋种鸭抗凝血样本中均未扩增到目的片段，表示均为阴性。
图1 乙型脑炎病毒抗体检测OD值Fig.1 OD value of antibody against JEV
对RT-PCR结果阳性的9号雏鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织样品进一步进行了绝对荧光定量RT-PCR检测，结果发现，所有的被检组织中都可检测到JEVE基因，其中病毒拷贝数最高的是脾脏组织，其次是肝脏（图2）。正常对照雏鸭组织未检测到JEVE基因。
图2 乙型脑炎病毒E基因片段的RT-PCR扩增Fig.2 PCR-amplified part of E gene from JEV
2.3 序列遗传进化分析 选取9号雏鸭脾脏样品，采用RT-PCR方法扩增全长E基因，并进行双向测序，测序结果提交GenBank进行Blast同源性分析。结果显示，扩增所得序列与多株JEV基因I型毒株的E基因同源性在95%以上，表明本研究扩增得到的JEV序列可确定为JEV基因I型病毒株，命名为JS201910。利用MEGA6.0构建扩增所得序列JS201910与GenBank下载的不同基因型的参考毒株的E基因序列的系统进化树（图3）。结果显示，其中FJ495189.1株与JS201910属于同一分支。
图3 乙型脑炎病毒在不同组织的分布Fig.3 The distribution of virus in different tissues
鸟类是JEV的扩增宿主之一，包括鸭子在内的水鸟在感染后可携带病毒血症，并通过节肢动物将JEV传播给人类[7]。鸟类在乙型脑炎的传播中起着重要的作用，而家禽如鸡、鸭等经常与人类和蚊子密切接触[11]；
在一些JEV流行地区，人类生活地附近饲养着大量的鸡、鸭，庞大的扩增宿主群体为JEV的传播提供了便利，加剧了JEV传播的风险[12-13]。考虑到这种传播威胁，本研究调查了鸭群中JEV的感染情况以及是否对养鸭业存在危害，为JEV的防控提供新的思路与见解。
血清学调查结果显示，位于江苏省中部地区的该养鸭场JEV感染率为75%（15/20）。根据中国国家知识基础设施数据库的2006-2012年中国猪群JEV流行病学数据，在中国18个省和自治区的22 343样本中，JEV平均阳性率为39.4%（8807/22343），JEV的最高阳性率为2010年的59.2%（3286/5548）[14]。在1979年云南省开展的一项研究中显示JEV在鸭子中的抗体阳性率也达到了75%[15]。本次调查结果反映了在东部沿海地区的鸭群中同样存在较高的JEV阳性率，高于猪群，虽然江苏省内JE的发生已有下降趋势，但媒介昆虫和宿主动物仍然存在，传播条件依旧具备，风险仍旧存在[16-18]。
图4 基于E基因核酸序列遗传进化树Fig.4 The phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of E gene
本次研究在病死雏鸭组织中检出了JEV基因，但未能分离病毒，究其原因，可能是由于病死雏鸭的病料是由鸭场采集，病料未能及时冻存导致病毒失活。在19份病死雏鸭病料中只检出了1份阳性和2份弱阳性，我们尚不能据此判断JEV对雏鸭的危害，但前期实验性感染研究证明，JEV对雏鸭具有致病性，并可引起雏鸭生长迟缓和死亡[9]，说明JEV对禽类养殖存在潜在的威胁。同属于黄病毒科的西尼罗河病毒（West nile virus, WNV）和坦布苏病毒（Tambusu virus, TMUV）都对禽类具有致病性[19-20]，随着大规模养殖业的快速发展，黄病毒包括JEV对禽类养殖产生的影响值得重视。
江苏省中部地区毗邻长江三角人口稠密地区，气候地理条件复杂，是多种自然疫源性疾病的疫源地和流行区[16]。JE作为一种自然疫源性疾病，宿主繁多[21]，对人类和动物健康威胁巨大。应当在鸭群等水禽群体中开展对JEV的长期密切监测，建立完整的疾病预防监测体系；
同时在春夏季交替蚊虫较多的季节加强防蚊措施，控制和消灭媒介昆虫，做好JE的防制措施。
