基于多指标含量测定的恒山黄芪特征成分研究△
时间：2022-12-08 19:10:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
郭雅璇，李蓉蓉，秦雪梅，李震宇*
1.山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006；
2.山西大学 化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006
黄芪是一种常用的传统中药，有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血的功效，用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久溃不敛[1]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版收载的黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。
目前，蒙古黄芪是商品黄芪药材的主流品种。其中产于北岳恒山山脉毗邻地区的蒙古黄芪俗称恒山黄芪，生长年限多在5 年以上，是药用黄芪中的优质品种，以“条直长、绵性大、粉性和甜味足”为特点[2-3]。随着黄芪用量和需求的增加，主产于内蒙古、甘肃等地，生长期为2 年的育苗移栽蒙古黄芪成为药用黄芪的主流商品。由于种植模式不同，虽然两者都是蒙古黄芪，但外观性状表现出明显的差异[4]。在药材交易市场中，恒山黄芪的价格远高于2年生移栽黄芪。
针对这2 种不同生长方式蒙古黄芪的质量差异，已有文献对其化学组成进行系统比较[5-8]。本课题组前期研究表明，恒山黄芪的特征成分可能为黄酮类成分[9]。毛蕊异黄酮葡萄糖苷是《中国药典》2020年版中黄芪项下的含量测定指标，仅测定这1 个成分难以全面评价黄芪中黄酮类成分的含量特征。芒柄花苷、黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷和黄芪异黄烷这几个黄酮类成分在黄芪中的含量也较高[9]，并且具有增强免疫、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗辐射损伤、神经保护、骨骼保护、降血糖及血管内皮细胞保护等多种药理作用[10-13]。因此，这些黄酮类成分也应纳入评价指标。虽然已有文献建立了同时测定黄芪中多种指标成分的高效液相色谱法（HPLC）[14-16]，但这些方法中色谱条件较为复杂，大多采用梯度洗脱，存在检测时间较长、液相梯度变化复杂进而影响方法的重现性等问题。
本研究在《中国药典》2020 年版中黄芪项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法的基础上，建立一种同时测定5 个黄酮类成分含量的方法，测定指标除了毛蕊异黄酮葡萄糖苷外，还选择了芒柄花苷、黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷和黄芪异黄烷；
同时收集12 批恒山黄芪，并以9 批甘肃、内蒙古产区的2 年生栽培蒙古黄芪为参照样本（以下简称参照黄芪），通过黄芪5 个黄酮成分结合黄芪甲苷的多指标含量测定，进一步分析恒山黄芪的特征化学成分。
1.1 仪器
1260 型高效液相色谱仪（Agilent 公司），包括G7111A 型四元泵、G7117C 型二极管阵列检测器（DAD）；
2695 型高效液相色谱仪（Waters 公司）；
HH-ZK4型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；
Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm，Agela Technologies公司）。
1.2 试药
黄芪样品共21 批，其中1～12 批为恒山黄芪，13～21 批为参照黄芪，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定均为蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，其详细信息见表1。
表1 黄芪样品信息
甲醇（纯度≥99%）、甲酸（色谱纯）均购于天津大茂有限公司；
乙腈（色谱纯，Fisher 公司）；
对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷（纯度≥99%，批号：102944）、芒柄花苷（纯度≥99%，批号：102715）、黄芪紫檀烷苷（纯度≥98%，批号：100760）、黄芪异黄烷苷（纯度≥98%，批号：100762）、黄芪异黄烷（纯度≥98%，批号：100466）均购自江苏永健医药科技有限公司；
对照品黄芪甲苷（纯度≥98%，批号：HA012079198，宝鸡市辰光生物科技有限公司）。
2.1 对照品溶液的制备
分别取对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷、黄芪异黄烷适量，精密称定。加甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.997 0、0.204 0、0.611 4、0.312 9、0.458 5 mg·mL-1的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
取样品粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流4 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过微孔滤膜，即得[1]。
2.3 色谱条件
Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；
0.2%甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脱（0～20 min，20%～40%B；
20～40 min，40%B）；
柱温为30 ℃；
紫外检测波长为230、260 nm；
流速为1 mL·min-1；
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，进样测定。
2.4 方法学考察
2.4.1 专属性考察 分别精密吸取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各10 μL，在2.3项下色谱条件下进样测定。
2.4.2 系统适用性试验 在2.3 项下色谱条件下对黄芪样品进行测定，分别计算5 个黄酮类化合物的理论板数（N）及分离度（R）。
2.4.3 线性关系考察 精密吸取2.1 项下混合对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成系列对照品溶液，按照建立的色谱条件进行分析。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。
2.4.4 精密度试验 取黄芪样品粉末制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件，当天连续进样6次和连续3 d进样测定，记录各成分峰面积。
2.4.5 重复性试验 精密称取黄芪样品粉末制备供试品溶液，共制备6份，按2.3项下色谱条件进样测定，计算各成分含量的RSD。
2.4.6 稳定性试验 精密称取黄芪药材粉末制备供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按2.3项下色谱条件进样测定，记录峰面积。
2.4.7 加样回收率试验 取已知含量的黄芪样品约0.5 g，按黄芪药材中5个黄酮类化合物含量的50%、100%、150%分别加入对照品储备液，每个质量浓度下平行备样3 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，测定5 个黄酮类化合物的含量，并计算回收率及RSD。
2.5 黄芪甲苷的含量测定
对照品溶液的制备、供试品溶液的制备及HPLC 条件参照《中国药典》2020 年版黄芪项下黄芪甲苷的含量测定[1]，并对21批样品进行测定。
2.6 水分测定
按照《中国药典》2020 年版（四部）中水分测定法[17]（通则0832第二法）测定黄芪样品中的水分。
2.7 数据处理
采用统SPSS 21.0 软件分析黄芪中化合物的含量均值，并对数据是否服从正态分布进行检验。采用软件GraphPad Prime 6 对恒山黄芪和参照黄芪中的化合物的含量进行t检验分析，绘制其含量柱状图，并对各化合物的含量进行受试者工作特征（ROC）曲线分析。采用Pearson 相关分析法分析化合物之间的相关性。将21 批恒山黄芪和参照黄芪中6 个成分的含量导入SIMCA-P 13.0 软件进行多元统计分析。
3.1 5个黄芪黄酮测定方法的建立
3.1.1 色谱条件的确立 在《中国药典》2020 年版规定的毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定条件基础上，洗脱时间延长至40 min，同时增加检测波长230 nm，即可同时测定5 个黄芪黄酮成分，且分离良好。其中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷在260 nm 下测定，黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷和黄芪异黄烷在230 nm下测定（图1）。
图1 黄芪中5个黄酮类化合物的HPLC图
3.1.2 方法学考察 专属性考察结果表明，供试品溶液中其他成分对待测成分无干扰，分析方法专属性良好，色谱图见图2。
图2 空白溶剂、混合对照品及黄芪供试品溶液的HPLC图
系统适用性试验结果表明，5 个黄酮类化合物的N及R均符合《中国药典》2020 年版要求。线性关系考察结果表明，5 个黄酮类化合物在各自质量浓度范围内具有良好的线性关系（表2）。
表2 黄芪中5个黄酮类化合物含量测定方法的系统适用性试验和线性关系考察结果
精密度试验结果显示，5 个黄酮类化合物日内精密度的RSD 为0.15%～0.59%，日间精密度RSD为0.32%～1.75%，表明方法精密度良好。重复性试验结果显示，5 个黄酮类化合物含量的RSD 为0.62%～1.94%，表明方法重复性良好。稳定性试验结果表明，5 个黄酮类化合物峰面积的RSD 为0.49%～1.58%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
加样回收试验结果见表3。5个黄酮类化合物质量分数为0.004%～0.125%，测定方法的加样回收率为96%～107%，均符合《中国药典》2020年版的规定。
表3 黄芪中5个黄酮类化合物加样回收试验结果
3.2 不同产地黄芪中黄酮类化合物含量分析
采用上述方法对21 批黄芪样品进行分析，扣除水分后5 个黄酮类化合物的含量测定结果见表4。《中国药典》2020 年版规定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的质量分数的限度为不低于0.02%，所有黄芪样品均符合规定。21 批黄芪样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷、黄芪异黄烷的质量分数均值分别为0.064%、0.022%、0.021%、0.012%、0.012%。在21 批黄芪样品中，除芒柄花苷外，其余黄酮类成分的含量波动均较大。此外，恒山黄芪中含量最高的黄酮为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，除个别批次外，芒柄花苷、黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷、黄芪异黄烷质量分数也均在0.01%以上。
表4 黄芪中水分及6个化合物质量分数测定结果 %
进一步采用统计学软件SPSS 21.0 对两组黄芪中5 个黄酮类化学成分的含量是否服从正态分布进行检验。由于样本数（3≤n≤50）较小，选用W检验判断是否服从正态分布。结果显示，恒山黄芪、参照黄芪中5 个黄酮类成分的含量均符合正态分布（P＞0.05）。进一步对恒山黄芪与参照黄芪进行t检验分析，结果显示恒山黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷、黄芪异黄烷的含量显著高于参照黄芪（P＜0.05），恒山黄芪中的芒柄花苷含量均值高于参照黄芪，但差异无统计学意义（图3A～E）。
3.3 黄芪甲苷的含量分析
参照《中国药典》2020 年版，对21 批黄芪样品中的黄芪甲苷进行测定，扣除水分后其结果见表4。《中国药典》2020 年版规定黄芪甲苷的质量分数的限度为不低于0.08%，除了编号4 的恒山黄芪低于规定限度外，其余样本均符合规定。21 批黄芪样品中黄芪甲苷的质量分数均值为0.16%。此外，恒山黄芪（P＞0.05）、参照黄芪（P＞0.05）中黄芪甲苷的含量均符合正态分布，t检验结果显示，黄芪甲苷的含量在两组中差异无统计学意义，但恒山黄芪中的黄芪甲苷含量均值高于参照黄芪（图3F）。
图3 恒山黄芪与参照黄芪中5个黄酮类成分及黄芪甲苷质量分数比较（± s）
3.4 相关性分析
按照《中国药典》2020 年版规定，黄芪项下只测定毛蕊黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷这2 个指标成分，因此通过Pearson相关分析现行含量测定指标与其他4 个黄酮类化合物之间的相关性（图4）。相关系数的绝对值在0.8～1.0表示极强相关，0.6～0.8表示强相关，0.4～0.6 表示中等程度相关，0.2～0.4 表示弱相关，0～0.2 表示极弱相关或无相关。毛蕊异黄酮葡萄糖苷与黄芪紫檀烷苷（r=0.93）、黄芪异黄烷苷（r=0.86）之间呈极强相关，与芒柄花苷（r=0.47）、黄芪异黄烷（r=0.56）之间呈中等程度相关。黄芪甲苷与芒柄花苷（r=-0.56）呈中等程度相关，与黄芪异黄烷（r=0.27）之间呈弱相关，与黄芪紫檀烷苷（r=0.02）、黄芪异黄烷苷（r=0.05）无相关。此外，《中国药典》2020年版的2个含量测定指标黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷（r=-0.19）呈极弱相关。因此，按照《中国药典》2020 年版方法，单独测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷也可以间接反映黄芪紫檀烷苷和黄芪异黄烷苷这2 个成分的含量高低，但不能反映芒柄花苷、黄芪异黄烷的含量高低。
图4 黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷与其他4个黄酮类化合物的相关性分析
3.5 多元统计分析
为了进一步分析恒山黄芪和参照黄芪之间的质量差异，以6 个成分的量为变量进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）。在由主成分1（PC1，56.4%）和PC2（27.9%）构建的散点图（图5A）中可以看出，恒山黄芪大多位于散点图右半部分，而参照黄芪大多位于散点图左半部分，说明恒山黄芪和参照黄芪的化学组成可能存在差异。进一步进行有监督的PLS-DA（图5B），模型验证结果显示（图5C），2条回归线斜率较大，左端任何一次随机排列产生的矩阵解释率参数（R2）、模型预测参数（Q2）均小于右端，说明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列Y变量的预测能力，证明模型有效，即恒山黄芪与参照黄芪之间的差异有统计学意义。
图5 恒山黄芪和参照黄芪指标成分含量的PCA和PLS-DA
3.6 ROC曲线分析
将恒山黄芪和参照黄芪5 个黄酮类化合物和黄芪甲苷的含量数据导入GraphPad Prism 6 进行ROC曲线分析。ROC 曲线下面积反映判断结果的准确性，曲线下面积越大说明结果越准确。毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪紫檀烷苷和黄芪异黄烷苷的曲线下面积分别为0.953 7、0.976 9、0.981 5，均大于0.9，说明可用于判别恒山黄芪和参照黄芪，其中黄芪异黄烷苷判别的可信度最高（表5）。
表5 黄芪中5个黄酮类化合物和黄芪甲苷含量的ROC曲线参数
本研究首先通过5 个黄芪黄酮类成分的混合对照品溶液选择最佳吸收波长，结果显示，203、210、230 nm 下黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷、黄芪异黄烷的响应均较高，但203、210 nm 下基线不稳定，因此选择在230 nm 下检测；
而毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷在260 nm 下响应较高，因此选择在260 nm 下检测。在《中国药典》2020 年版黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法的基础上，不改变备样方法和色谱洗脱条件，仅通过延长洗脱时间并增加1 个检测波长，即可在毛蕊异黄酮葡萄糖苷准确测定基础上增加其他4 个黄酮类成分的含量测定。与现有的黄芪黄酮多指标含量测定方法相比检测时间短、液相梯度变化简单，5 个黄酮类成分均在最大吸收波长下进行测定，可推广用于黄芪药材的质量评价。对21 批黄芪的含量测定结果表明，恒山黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪紫檀烷苷、黄芪异黄烷苷、黄芪异黄烷4 个黄酮类化合物的含量显著高于参照黄芪，而芒柄花苷、黄芪甲苷含量略高于参照黄芪，但差异无统计学意义。ROC 曲线分析表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪紫檀烷苷和黄芪异黄烷苷判别的可信度较高，可作为恒山黄芪的特征判别成分。在今后的研究中笔者将进一步增加黄芪样品批次，确证恒山黄芪的化学特征。
