鄂尔多斯细毛羊LMNB1基因和TXNIP基因多态性与羊毛性状关联分析
时间：2022-12-04 11:15:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
付雪峰,谷 英,吴翠玲,德德玛,孟根曹,斯庆毕力格,斯登丹巴*,田可川
(1.新疆畜牧科学院 畜牧研究所,新疆绒毛用羊遗传育种与繁殖实验室(XJYS1105),新疆 乌鲁木齐 830011;2.鄂尔多斯市农牧业科学研究院,内蒙古 鄂尔多斯 017100;3.新疆师范大学 生命科学学院,中亚区域跨境有害生物联合控制国际研究中心/新疆特殊环境物种多样性应用与调控实验室,新疆 乌鲁木齐 830017;4.内蒙古鄂尔多斯市乌审旗家畜改良工作站,内蒙古 鄂尔多斯 017300;5.山东省农业科学院 畜牧兽医研究所,山东 济南 250100)
鄂尔多斯细毛羊是1985年育成命名的毛肉兼用细毛羊培育品种，乌审旗为核心产区。鄂尔多斯细毛羊及其产品在国内外市场具备较大竞争潜力[1-2]。但随着人们日益增长的物质文化需求和纺织工艺技术的提高，国内外毛纺产品开始向轻薄、柔软、挺括、高档方向发展[3]。因此鄂尔多斯细毛羊高产、超细型群体的选育成为目前主要任务。
核纤层蛋白(lamin B1，LMNB1)基因定位绵羊5号染色体上，有11个外显子。LMNB1在器官发育和组织分化过程中具有重要调节作用，是核纤层重要的组成部分[4-5]。硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)是α-视紫红质抑制蛋白家族成员之一。TXNIP基因也被称为VDUP1基因，定位在绵羊1号染色体上，有8个外显子。TXNIP作为一个多功能的蛋白质，可以调节细胞凋亡、线粒体氧化磷酸化、炎症反应等[6]。课题组前期通过qRT-PCR法发现相对于细毛组，LMNB1基因和TXNIP基因在超细毛组的绵羊皮肤中表达上调[7]。另外在细毛组和粗毛组绵羊皮肤的基因组表达谱芯片分析，发现TXNIP基因在细毛组上调[8]。提示LMNB1基因和TXNIP基因在羊毛性状中参与调控作用。目前LMNB1基因和TXNIP基因在绵羊羊毛性状研究较少。
本研究联合DNA混池和Snapshot检测技术，对鄂尔多斯细毛羊LMNB1基因和TXNIP基因进行多态性分析，旨在加快鄂尔多斯细毛羊超细型群体选育进程。
1.1 样品采集
从内蒙古自治区鄂尔多斯市的乌兰陶勒盖镇(n=41)、嘎鲁图镇(n=97)、苏力德苏木(n=134)、图克镇(n=91)、乌审召镇(n=99)5个镇，总共采集462只周岁鄂尔多斯细毛羊母羊作为试验动物。对试验母羊静脉采血至5 mL抗凝管中，放入-20 ℃冰箱保存，用于后续提取血液基因组DNA。同时在试验羊左侧体中线上方肩胛骨后缘10 cm处采集羊毛样品。将羊毛样品送往农业农村部种羊及羊毛羊绒质量监督检验测试中心，通过纤维直径光学分析仪(OFDA 2000)检测羊毛样品的平均纤维直径、纤维直径变异系数[9]。最后收集试验羊群的2020年鉴定记录，主要包括产毛量、羊毛纤维长度等。
1.2 构建DNA混池
利用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取血液基因组DNA。取4 μL DNA，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，取1 μL DNA，利用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。在测得的羊毛纤维直径数据中分别选取20个极端个体(极细n=10，极粗n=10)DNA样品。其中极细组平均纤维直径为16.36 μm，极粗组为21.50 μm。将极端个体DNA浓度通过核酸蛋白检测仪检测并加入ddH2O调整到一致。从20个极端个体中取分别取10 μL，构建2个DNA混合池(极细DNA混合池，极粗DNA混合池)。
1.3 PCR扩增及测序
根据Ensembl核酸数据库中LMNB1基因(登录号：ENSOART00000019747.1)和TXNIP基因(登录号：ENSOART00000022506.1)序列，利用Premer Premer5.0设计引物，引物序列如表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以2个混池DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：PCR Mixture 10 μL，上下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，加蒸馏水至20 μL。将建立好的PCR体系放入PCR仪中反应。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。对条带明亮的PCR产物直接送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。测序结果利用DNASTAR软件的SeqMan程序进行序列拼接和校正，用BioEdit软件比对峰图。
表1 引物信息表
1.4 Snapshot检测
根据双向测序筛选的突变位点设计上、下游引物和延伸引物，引物信息如表2。由北京奥科鼎盛生物科技有限公司使用Snapshot基因分型技术对462只个体进行检测，利用ABI 3730XL测序仪进行分型。最后对每个位点随机挑选3个样品进行一代测序，验证Snapshot分型检测结果。
表2 Snapshot检测扩增引物和延伸引物
1.5 统计分析
利用Popgene软件计算SNPs的基因频率(gene frequency)、基因型频率(genotype frequency)、有效等位基因数(Ne)、基因杂合度(He)、多态信息含量(PIC)，以及Hardy-Weinberg平衡。利用SAS 9.2软件分析SNPs不同基因型与鄂尔多斯细毛羊毛用性状关联性。结果以最小二乘均值±标准误形式表示，线性模型为：
Yick=μ+Gi+Fe+eick
公式中:Yick.细毛羊个体表型值；
μ.群体均值；
Gi.基因型SNP效应；
Fe.场效应；
eick.随机误差。
2.1 DNA和PCR检测结果
提取的基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA条带明亮，结果如图1。利用核酸蛋白检测仪检测DNA，OD260∶OD280为1.8～2.1，说明提取的DNA质量与纯度满足后续试验要求。LMNB1基因和TXNIP基因PCR产物检测结果见图2。PCR产物与预期片段大小一致，无杂带，符合后续试验的要求。
图1 基因组DNA检测结果
图2 LMNB1和TXNIP基因PCR产物检测结果
2.2 混池结果分析
对鄂尔多斯细毛羊2个基因5个PCR片段混池测序发现了6个突变。其中LMNB1基因P1片段上发现了2个突变(Indel1和SNP1)，P2片段上发现了1个突变(SNP2)，P3片段上发现了2个突变位点(SNP3和SNP4)，P4片段上未发现突变。TXNIP基因P5片段上发现了1个突变(SNP5)。LMNB1基因和TXNIP2个基因6个突变信息见表3。其中Indel1是LMNB1基因第2内含子上TATT 4个碱基的缺失；
SNP1-SNP4为LMNB1基因外显子上的同义突变；
SNP5为TXNIP基因3"UTR区突变。
表3 LMNB1基因和TXNIP基因突变位点信息表
2.3 Snapshot检测分型及验证结果
利用Snapshot分型技术检测462只鄂尔多斯细毛羊LMNB1基因和TXNIP基因6个突变位点分型峰图见图3。在Snapshot检测中6个突变位点成功分型，并均具有3种基因型。其中Indel1、SNP1、SNP3延伸产物为正向延伸，SNP2、SNP4、SNP5延伸产物为反向延伸。另外，Indel1和SNP1基因型有相同的分型模式，即当Indel1为TATT 4个碱基缺失(AA基因型)时，SNP1为CC基因型；
当Indel1为TATT 4个碱基插入(TT基因型)时，SNP1为TT基因型，推测Indel1和SNP1 2个突变存在连锁，因此后续将2个突变位点Indel1-SNP1合并分析。根据Snapshot分型检测结果，随机选择6个突变不同基因型个体进行一代测序，其中Indel1、SNP1、SNP3为反向测序，SNP3、SNP4、SNP5为正向测序，验证结果见图4，一代测序与Snapshot分型结果完全匹配，说明Snapshot分型结果可靠。
图3 LMNB1基因和TXNIP基因6个突变位点Snapshot分型结果
图4 LMNB1基因和TXNIP基因6个突变位点分型验证
2.4 遗传多态性分析
鄂尔多斯细毛羊LMNB1基因和TXNIP基因6个突变基因型频率、等位基因频率和χ2计算结果如表4所示。由表4可知，Indel1-SNP1优势基因型为TTTT基因型； 表4 LMNB1基因和TXNIP基因的基因型频率和等位基因频率 利用SAS 9.2软件对鄂尔多斯细毛羊LMNB1基因和TXNIP基因6个突变位点多态性与羊毛性状相关性分析如表5。其中LMNB1基因的SNP2、SNP3、SNP4等4个突变位点对鄂尔多斯细毛羊羊毛性状均无显著影响。LMNB1基因Indel1-SNP1突变位点ATCT基因型和TTTT基因型纤维直径变异系数显著高于AACC基因型(P<0.05)，ATCT基因型和TTTT基因型之间差异不显著(P>0.05)。TXNIP基因SNP5突变位点TT基因型平均纤维直径显著高于CT基因型(P<0.05)，极显著高于CC基因型(P<0.01)。CC基因型和CT基因型之间平均纤维直径差异不显著(P>0.05)。 表5 LMNB1基因和TXNIP基因群体多态性分析 表6 LMNB1基因和TXNIP基因突变位点与羊毛性状关联性分析 鄂尔多斯细毛羊羊毛综合品质优良，被毛闭合性良好，密度大，细度以66～70支为主。群体羊毛性状遗传稳定[2]。在本研究中发现的6个突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态，进一步证明鄂尔多斯细毛羊遗传性能保持相对稳定，利用传统的育种方法很难再提高羊毛品质及生产性能。羊毛纤维直径、纤维长度、产毛量决定了羊毛纤维的品质，是绒毛羊产业重要的经济性状和数量性状，受微效多基因控制[10]。目前对绵、山羊绒毛性状相关基因多态性的研究主要集中在角蛋白家族基因和角蛋白关联蛋白家族基因中[11-14]，未见LMNB1基因和TXNIP基因多态性影响羊毛性状的报道[15]。同时目前针对鄂尔多斯细毛羊羊毛性状相关基因的研究较少[16]。因此本研究结合课题组前期研究进展，首次对鄂尔多斯细毛羊LMNB1基因和TXNIP基因多态性与羊毛性状相关性进行研究。 分子标记技术可以通过检测动物在基因或基因型上发生的变异来表现生物个体或种群间的差异。基于凝胶电泳SNP检测方法有限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)，梯度凝胶电泳(DGGE)、等位基因特异性 PCR(AS-PCR)等。基于高通量的SNP检测，有高分辨率熔解曲线(HRM)、直接测序法、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测等[17-18]。本研究使用的Snapshot检测SNP分型是一种以单碱基延伸原理为基础，同时利用多重PCR对多个已知SNP位点进行遗传分型的方法。该方法适用于多个突变位点的检测、数据完整性高、试验结果可靠[19]。 在LMNB1基因的研究中发现，鄂尔多斯细毛羊外显子区域相对保守，检测到的4个突变位点均为同义突变，未导致氨基酸发生改变。在过去主要针对错义突变的研究，因为错义突变导致氨基酸改变，从而影响蛋白质的合成及其功能。然而同义突变一定程度上可能会影响mRNA稳定性、改变蛋白质合成速率、影响蛋白折叠及构象等[20-21]。值得注意的是，在LMNB1基因第2内含子上发现了TATT 4个碱基的缺失(Indel1)，同时通过Snapshot检测分型可知Indel1和LMNB1基因第3外显子上的SNP1存在连锁。其AACC基因型个体的纤维直径变异系数显著低于ATCT基因型和TTTT基因型。羊毛纤维直径的变异系数表示了纤维直径细度的均匀程度，直接影响纤维的加工性能及成品。在生产实践中，造成羊毛细度不均的原因很多，如品种、年龄、性别、生长部位和饲养条件等[22-23]。在本研究中对周岁鄂尔多斯细毛羊母羊肩胛部取样，减少了试验误差。因此LMNB1基因Indel 1-SNP1突变位点值得我们进一步研究。同时也提示我们内含子区域的研究不容忽视。 目前对TXNIP的研究主要集中在人类肥胖、糖尿病[24]、高血压和神经疾病等[25]，在绵羊上的研究较少。田月珍等[15]通过PCR-SSCP法对289个中国美利奴羊(新疆型)TXNIP基因研究，发现2个同义突变位点对羊毛细度影响不显著。本研究分析发现TXNIP基因3"UTR的SNP5突变位点与羊毛纤维直径极显著相关，随着C等位基因拷贝数的增加，纤维直径减小。基因序列3"URT区域为mRNA 3′末端非翻译区，mRNA成熟前的3"UTR区随着物种的进化其序列不断延伸。基因3"URT区可以调控mRNA的稳定性和翻译。另外，哺乳动物miRNA通常作用于3"UTR区域[26]。因此，后续将深入研究TXNIP基因3"UTR区的SNP5突变位点对羊毛性状影响的分子机制。 本研究在鄂尔多斯细毛羊LMNB1和TXNIP两个基因中发现了6个突变位点，在鄂尔多斯细毛羊群体中呈Hardy-Weinberg平衡。LMNB1基因Indel1-SNP1突变位点对纤维直径变异系数影响显著。TXNIP基因SNP5突变位点对平均纤维直径影响极显著。该研究对鄂尔多斯细毛羊超细型群体的选育提供了试验依据。
SNP2为CT基因型；
SNP3为AG基因型；
SNP4为AA基因型；
SNP5为CC基因型。同时6个突变位点的χ2值均未达到显著水平，Hardy-Weinberg平衡。另外，鄂尔多斯细毛羊LMNB1基因和TXNIP基因6个突变位点遗传纯合度(Ho)、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)、多态性信息含量(PIC)见表5。由表5可知，6个突变位点纯合度较高，有效等位基因数分别为1.807、1.805、1.807、1.324、1.812。根据突变位点多态性标准：PIC>0.5为高度多态，0.25
2.5 6个突变位点与羊毛性状相关性分析
